葛根素对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用❋

李 宁，郝志梅，崔书霞，熊瑞媛，李继安，马宇杰，田 炜，徐菁蔓,6△

(1. 河北联合大学医学实验研究中心心脏研究所，河北 唐山 063000；2. 河北联合大学管理学院，河北 唐山 063000；3. 解放军285医院，河北 邯郸 056000；4. 河北联合大学中医学院，河北 唐山 063000；5. 河北联合大学附属开滦医院ICU，河北 唐山 063000；6. 天津医科大学生理学与病理生理学系，天津 300070)

氧化应激损伤是引起心脏缺血/再灌注损伤的三大机制之一。研究发现，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol-3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(v-akt-murinet hymoma viral onco- gene homolog, Akt)信号途径通过使糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthesis kinase-3, GSK-3β)的Ser9位点磷酸化失活，进而抑制线粒体通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的开放而减少心肌细胞凋亡和坏死，减轻氧化应激诱发的心肌细胞损伤[1]。近些年的研究发现，葛根素(puerarin，Pue)凭借其抑制炎性介质产生和释放、改善微循环、抗氧化应激、抗细胞凋亡、抑制钙超载以及改善内皮功能等作用在多种心脏疾患的防治过程中发挥一定的作用[2, 3]。然而，有关Pue心肌保护作用细胞内信号传导机制研究的报道仍较少。本研究利用体外培养心肌H9c2细胞株，从细胞水平探讨GSK-3β、PI3K/Akt等细胞内信号因子是否参与Pue抗心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验药品

葛根素由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 细胞

大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株，购自于美国ATCC公司。

1.3 试剂及主要仪器

H2O2购自美国 Sigma 公司；TMRE荧光染料购自美国Invitrogen公司；渥曼青霉素(wortmannin, Wort)和MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所； p-Akt(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)多克隆抗体均购自美国cell signaling公司；GAPDH抗体为中杉金桥生物有限公司产品；37℃二氧化碳孵箱、超低温冰箱为Thermo Forma 公司产品；FV1000激光共聚焦显微镜为日本OLYMPUS公司产品；JY200C电泳仪、半干转运系统、酶标仪均为BIO-RAD公司产品。

1.4 细胞培养

用10 ml含10%FBS的完全DMEM培养基重悬H9c2细胞并转入50 ml培养瓶中，放置37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中培养，待细胞贴壁达培养瓶底壁面积90%以上时进行传代。将消化下来的细胞离心重悬后分别取2 ml细胞悬液接种于共聚焦或蛋白提取专用培养皿中，于实验前倒掉培养基，用PBS冲洗2次后换2 ml台氏液(单位mM: NaCl 140, KCl 6, MgCl21, CaCl21, HEPES 5, 葡萄糖 5.8)于孵箱中继续培养2 h。

1.5 实验分组

将培养的H9c2细胞分为4组：①空白对照组；②H2O2组，加入650 μMH2O2处理细胞20 min；③Pue+H2O2组，在H2O2(650 μM)处理之前分别加入Pue(0.001～1 μM)处理20 min；④Wort+Pue+H2O2组，Pue和H2O2处理时间同前，于加入Pue之前加入Wort(1 μM)处理10 min；⑤Wort+ H2O2组，加入Wort(1 μM)处理10 min后加入H2O2处理细胞20 min。

1.6 测定线粒体膜电位

在应激条件下mPTP大量开放，分子量小于1.5 kD的物质，如H+和水可以自由地通过线粒体膜，导致线粒体肿胀、线粒体膜电位消失、外膜破坏，进而引起细胞凋亡和坏死。因此，很多研究利用线粒体膜电位的改变作为mPTP开放状态的指针[4, 5]。TMRE是1种可自由通过细胞膜无毒性的荧光染料，通过测定TMRE荧光强度的改变确定线粒体膜电位的变化。实验前，将TMRE(100 nM)加入到共聚焦专用培养皿中孵育20 min，用波长543 nM的氦氖激光激发荧光染料TMRE呈现红色荧光，扫描记录加入H2O2处理0 min和20 min图像，对其荧光值进行分析。

1.7 MTT法检测细胞增殖

选取对数生长期的细胞进行细胞计数，使得96孔板每孔加入100 μL约2000个细胞。按照实验分组处理细胞，每孔重新换培养基100 μL后加入10 μLMTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h。随后每孔再加入100 μLFormanzan溶解液，在细胞培养箱内继续孵育15 min左右，直至在显微镜下观察发现Formanzan全部溶解后，用酶标仪测定570 nM波长处的吸光度(OD值)。细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.8 Western blotting

弃去培养皿内液体，用冷PBS冲洗3次，每个皿内加入含有PMSF的蛋白裂解液50 μL，放置在冰上裂解40 min。将收集细胞于4℃ 12000 r/min条件下离心5 min取上清，用BCA法测定蛋白质含量，每个泳道蛋白上样量20 μg，用10%～12%的 SDS- PAGE分离蛋白质，PVDF膜转膜、封闭，将膜放入一抗中4℃过夜，TBST冲洗3次，将膜加入相应二抗中室温孵育2 h，TBST冲洗后用ECL显色，扫描后用ImageJ图像分析软件对图像进行分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度葛根素对心肌细胞mPTP影响

表1图1显示，H2O2(650 μM)处理H9c2细胞20 min后，TMRE荧光强度明显降低(P<0. 05)，提示氧化应激能够增加mPTP开放引起H9c2细胞线粒体损伤。与H2O2组比较， Pue(0.001～1 μM)+H2O2组TMRE荧光减弱程度明显减轻(P<0.05)，提示Pue可以抑制mPTP开放，减轻氧化应激所引起的心肌细胞线粒体损伤。

表1 激光扫描共聚焦显微镜检测线粒体膜电位

注：与正常对照组比较：*P<0.05

图1 激光扫描共聚焦显微镜检测线粒体膜电位H2O2处理0 min和20 min,图中浅色为TMRE荧光

2.2 葛根素对细胞活性的影响

表2显示，MTT法对细胞活性检测结果显示，与H2O2(650 μM)处理组比较，Pue(0.1 μM)预处理组细胞生存率明显提高(P<0.05)，表明Pue能够减轻氧化应激造成的心肌细胞损伤。

2.3 葛根素对 GSK-3β 磷酸化的影响

表3图2显示，Western blotting 结果显示与空白对照组比较，H2O2(650 μM)处理组p-GSK-3β(Ser9)表达明显降低(P<0.05)，提示H2O2通过抑制GSK-3β的磷酸化失活，进而引起心肌细胞损伤。然而，Pue(0.1 μM)能够明显增加p-GSK-3β(Ser9)的表达水平(P<0.05)，表明Pue通过增加GSK-3β的磷酸化失活抑制mPTP开放，进而减轻氧化应激引起的心肌细胞线粒体损伤。

表2 葛根素对细胞活性的影响

注：与正常对照组比较：*P<0.05;与H2O2组比较：#P<0.05

表3 Westem blotting检测p-GSK-3β(Ser9)和p-Akt(Ser473)蛋白的表达

注：与正常对照组比较：*P<0.05;与H2O2组比较：#P<0.05

图2 Western blotting检测p-GSK-3β(Ser9)和p-Akt(Ser473蛋白的表达

2.4 葛根素对 Akt 磷酸化的影响

表3图2显示，与空白对照组比较，Pue(0.1 μM)未能使p-Akt(Ser473)表达增加；与 H2O2组比较，加入Pue(0.1 μM)预处理后p-Akt(Ser473)的表达水平也没有明显改变，说明Akt并没有在Pue抗心肌氧化应激损伤的保护作用中发挥作用。

2.5 PI3K抑制剂Wort对葛根素抗心肌氧化应激损伤作用的影响

表1所示，与Pue+ H2O2组比较，Wort+Pue+H2O2组的TMRE荧光强度改变不明显，也提示PI3K/Akt信号通路并未参与Pue的抗心肌氧化应激损伤作用。

3 讨论

Pue是从豆科植物葛根中提取的一种异黄酮化合物，是葛根的主要活性成分。最初由于其能够增强胰岛素受体敏感性，减轻2型糖尿病患者的胰岛素抵抗进而引起广泛关注[2]。近年来研究发现，Pue能够减轻糖尿病大鼠的心肌氧化应激损伤以及心肌细胞凋亡[6, 7]。本研究中MTT结果显示，Pue对氧化应激诱发的心肌H9c2细胞损伤具有保护作用。同时，激光扫描共聚焦显微镜检测线粒体膜电位发现，与H2O2处理组比较，Pue预处理后心肌细胞线粒体膜电位减弱程度明显减轻，进一步说明Pue通过抑制mPTP的开放而减轻氧化应激造成的心肌细胞线粒体损伤。

糖原合成酶激酶-3(glycogen synthesis kinase-3, GSK-3)有2种形式，GSK-3α(51 kDa)和 GSK-3β(47 kDa)，其中GSK-3β是一种普遍存在于真核生物中的多功能丝/苏氨酸(serine/threonine, Ser/Thr)类激酶，其通过使底物蛋白磷酸化来调节糖原的合成代谢，参与细胞的分化、增殖、黏附及细胞凋亡等一系列过程[8]。GSK-3β被认为是调控心肌细胞mPTP开放的关键因子之一，吗啡[4]、腺苷[9]、白藜芦醇[10]等很多药物都能够通过抑制GSK-3β的活性来阻止mPTP开放，从而发挥心肌保护作用。本研究结果显示，Pue预处理能够显著增加GSK-3β(Ser9)磷酸化，提示它也可以通过使GSK-3β失活阻止mPTP开放，减轻氧化应激诱发的心肌细胞损伤。

PI3K/Akt信号通路在缺血预处理和缺血后处理诱发的心脏保护中发挥着关键作用，同时PI3K/Akt信号通路被认为是调节GSK-3β活性的关键信号通路之一[11]。然而本实验结果显示，PI3K/Akt信号通路并未在Pue抗心肌细胞氧化应激损伤的保护作用中发挥作用。

综上所述，Pue通过使GSK-3β失活抑制mPTP

的开放，从而减轻氧化应激诱发的心肌细胞损伤，而PI3K/Akt信号传导通路并未参与此过程。

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