几种肝郁动物造模方法比较及鼠笼加报纸固定束缚法的效果观察❋

黄 聪，倪祥惠，曹 峰，赵 博，张小容，叶金竹，吴大梅，吴 菁

(贵阳中医学院, 贵阳 550002)

早期中医界并没有肝郁证动物模型，由于肝郁证常常表现出精神抑郁、烦躁易怒等情志改变，类似现代医学的抑郁症，故中医学界常常借用现代医学之抑郁症动物模型研究肝郁证。

结合现代医学的抑郁症动物模型，中医学界又创造出具有中医特色的肝郁证动物模型的制作方法，研究这些方法大概可分为两大类：一是应用药物造成急、慢性中毒损伤等复制模型，如艾叶注射法[1]、CCl4注射法[2]、肾上腺素注射法[3]等；二是情志刺激造模法，如颈部带枷单笼喂养法[4]、夹尾激怒打斗法[5]、束缚法(改良)[6]、捆绑法[7]、慢性轻度不可预见性应激(CUMS)造模法[8]以及居住者-入侵者(resident-intruder paradigm)造模法[9]。根据课题的需要，我们选择了情志刺激造模方法，在实验过程中比较了颈部带枷单笼喂养法、夹尾激怒打斗法、束缚法(改良)、捆绑法、慢性轻度不可预见性应激(CUMS)造模法以及居住者-入侵者造模法，发现这些造模方法存在各自的优缺点，现将使用体会报告如下。

1 常见非药物造模法使用体会

1.1 颈部带枷单笼喂养法

颈部带枷单笼喂养法是一个较经典的方法，在实验过程中较难以控制的是模具颈部孔洞的大小，孔洞稍大大鼠即可在前肢协助下脱离模具，而孔洞稍小即会因动物频繁抵抗试图脱离枷具而出现头颈部皮肤损伤。

1.2 夹尾激怒打斗法

作为经典造模方法的夹尾激怒打斗法，在实验过程中，夹尾大鼠常会出现攻击其余大鼠的现象，容易操作，易达到实验目的，但是在实验中常出现大鼠躯体损伤现象。

1.3 束缚法(改良)

束缚法以及改良束缚法的操作方法较多，有专门的束缚笼、T型束缚架、钢制束缚筒等，其操作简单，易达到实验目的。使用中发现，专门的束缚笼、钢制束缚筒经常因不能很好地适应大鼠体型，造模过程中大鼠有着较大的活动空间。

1.4 捆绑法

捆绑法可以视为一种较特殊的束缚法，就是使用绷带束缚大鼠肢体限制活动的造模方法，是一种使动物产生“郁怒”从而导致“肝郁证”动物模型的特殊方法。这种方法看似简单，但是在具体操作过程中发现该方法实现常有如下困难：①用绷带固定，大鼠大多会将绷带咬断；②用绷带捆绑大鼠肢体，如果太紧就会出现大鼠肢端血液回流障碍，出现肢端水肿，过度紧时间长还会出现肢端坏死；如果稍松则很难将大鼠固定住，大鼠很容易挣脱，前肢尤其容易挣脱。

1.5 慢性轻度不可预见性应激造模法(CUMS模型)

慢性轻度不可预见性应激造模法是目前现代医学常用的制作抑郁症的经典方法，一般3周即可完成造模，是由CMS模型(chronic mild stress)减轻刺激强度、延长持续时间演变而来。操作过程中，操作相对容易，但是操作流程相对复杂，且存在刺激强度不好把握的情况，如无规则摇晃、如何把握其强度等问题。但是总体而言，该造模法是信度、效度较好的方法。

1.6 居住者-入侵者造模法

居住者-入侵者造模法是近年出现的抑郁证造模方法，也是利用动物之间争斗导致动物情志异常的造模方法，该方法相对容易操作，但常有不同种或者不同窝雄性动物之间相安无事的情况出现，导致动物造模失败。

2 自创鼠笼加报纸固定束缚法

在实验过程中，我们利用大鼠钻洞的习性，自创鼠笼加报纸固定束缚法束缚大鼠，使用普通大鼠鼠笼操作，简单方便，其具体方法如下：利用大鼠钻洞的习性，使大鼠钻入鼠笼，如大鼠不钻可轻拉鼠尾，大鼠即会自动钻入位于头前部的鼠笼，然后用报纸填塞大鼠后面的鼠笼空间(也可使用其他纸张，一般报纸既柔软又有一定强度)，注意报纸要往鼠笼边的方向上塞紧，以防松动。放置大鼠时，要让大鼠四肢在上，束缚期间可以通过观察大鼠能否自行翻转判断束缚是否松动。

依据湖南陈泽奇等[10]将30名肝气郁结病人(应用湖南医科大学中西医结合研究所经鉴定的标准诊断)，以精神情志变化为特征分为偏烦躁型、偏抑郁型和中间型(即抑郁、烦躁并见或交替出现者)，测定病人血浆中去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)的含量，发现平均NE、 E含量与健康人相近，相同分型不同病种间NE、E含量相近，但是偏烦躁型病人的NE、E含量显著高于偏抑郁型和中间型病人，偏抑郁型病人的NE、E含量显著低于中间型病人及健康人对照组。这一点与抑郁症和躁狂症中枢神经递质的变化相仿佛(有研究表明，在抑郁或躁狂时中枢5-HT含量均低下，在抑郁时中枢NE缺乏或相对缺乏，躁狂时中枢NE过多)。借鉴目前抑郁大鼠常用的检测神经递质以判断抑郁模型成功与否的方法，课题组对比观察了使用鼠笼加报纸固定束缚法与慢性轻度不可预见性应激造模法造模情况，比较了2种造模方法造模第1、2、3周模型大鼠体质量变化值以及第21天大脑海马、额叶中神经递质5-HT、DA、NE含量的变化，发现两者之间在体质量上差异有统计学意义，而神经递质比较差异无统计学意义。

2.1 材料与方法

2.1.1 实验动物及分组 健康SPF级雄性SD大鼠40只，体质量150～200 g，来自第三军医大学医学实验动物中心(许可证号SCXK(渝)2012-0005)，随机分为2组并编号各20只，每5只1笼。

2.1.2 试剂 大鼠脑递质多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海雅吉公司，系分装美国R&D 公司产品。

2.1.3 造模方法 2组动物分为束缚组和慢性轻度不可预见性应激(CUMS模型)造模组。动物适应性喂养1周后，束缚组每天使用鼠笼加报纸固定束缚法束缚2 h。慢性轻度不可预见性应激(CUMS模型)造模组每天随机使用束缚2 h、无规则摇晃45 min、45℃热刺激5 min、4℃冷水游泳5 min、昼夜颠倒24 h、禁食24 h、禁水加空瓶刺激12 h、湿笼24 h这8种刺激中1～2种。造模过程中有3只动物死亡。

2.1.4 动物及标本处理 观察动物反应，第21天处理动物。所有动物均按30 mg/kg体质量用3%戊巴比妥钠麻醉后断头，冰上取海马以及额叶组织，-70℃冰箱保存备用。

标本称重后，按1∶10(w∶v)加入0℃磷酸缓冲液(PBS)，使用匀浆器匀浆后，12000 r/min4℃离心15～20 min后取上清，分别按照试剂盒要求检测大鼠额叶、海马多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)含量。

2.2 结果

表1显示，所有动物均于造模前、第1、2 周及处死前称重，每组体质量变化值以及神经递质含量均符合正态分布。2组动物中，单纯束缚组体质量均较CUMS模型组增多，且同一时间段体质量变化值比较除第2周没有差异外，其余时间段比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 模型动物不同时间段体质量变化值比较

注：与相应束缚组比较：**P<0.01

表2显示，尽管2组动物在同一时间段体质量变化差异有统计学意义，但是在第21天时大脑额

叶、海马中神经递质的含量没有差异。

表2 模型动物第21天时海马、额叶DA、NE、5-HT值比较

2.3 讨论

慢性轻度不可预见性应激造模法(CUMS模型)是信度、效度较好的经典抑郁症造模方法，中医学也常借用来制作肝郁(脾虚)证动物模型。通过以上研究表明，应用慢性轻度不可预见性应激造模法制作的肝郁证模型动物存在着体质量显著减轻的情况，这表明动物在造模期间机体消耗较多或合并有合成代谢较差。

体质量的减轻并不作为肝郁证的临床表现特征。国内外的一些流行病学调查及临床报道也表明，许多慢性疲劳患者在发病前曾有过长期精神紧张、不愉快的生活事件及生活习惯的改变等(也即与心理、社会等应激因素有关)，发病后常伴有精神抑郁或急躁易怒、健忘等精神神经症状、认知行为的改变及免疫功能紊乱等，临床中肝郁证病人可以出现体质量减轻的情况，但其减轻是肝郁的必然结果还是或然症？肝郁证与体质量减轻之间有否因果关系？如有什么样的因果关系还有待探讨。

综上所述，作为制造肝郁证动物模型的慢性轻度不可预见性应激造模法，是否能够准确地反映肝郁证值得进一步商榷。本课题组采用的鼠笼加报纸固定束缚法对体质量的影响远较慢性轻度不可预见性应激造模法要轻，大脑内神经递质的含量变化在造模第3周时没有差异，且不需要特殊设备，操作简便易行，可以作为一种备选的肝郁证造模方法。

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