利咽解毒方防治大鼠急性放射性口腔黏膜炎作用机制的研究*

张 红 张志芳 唐利文

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

急性放射性口腔黏膜炎（ROM）是头颈部恶性肿瘤放射治疗的主要剂量限制因素及临床亟待解决的问题之一，发病机制尚不明确，涉及多种细胞因子及蛋白的参与［1-3］。 中医药治疗取得了不错的效果［4-6］。 利咽解毒方为我院学术带头人、本文第二作者张志芳教授的自拟方，也是本院治疗ROM的常用方。本实验拟观察利咽解毒方对ROM的影响，以进一步指导临床研究，提高急性ROM中医治疗水平。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠50只，鼠龄10～11周，体质量（220±10）g（湖南中医药大学校动物实验中心提供），雌雄各半，在干燥、空气流通、12 h光暗交替的条件下自由进食水、食，所有动物在进行实验前均环境适应性饲养1周以上，以最大限度降低动物的应激反应，避免对实验产生干扰。

1.2 药物与制备 利咽解毒方所用药物按处方量一次性购自湖南中医药大学第一附属医院中药房。将药物按比例称取后，水煎，过滤，浓缩，装入瓶中密封保存于4℃冰箱中，灌胃时水浴至36℃。根据“常用动物与人体表面积比值表”计算，高剂量组每毫升药液含生药0.21 g（相当于临床用量的20倍），低剂量组每毫升药液含生药0.11 g（相当于临床用量的10倍）

1.3 试剂与仪器 兔抗缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）多克隆抗体；兔抗环氧化酶-2（COX-2）多克隆抗体；兔抗白介素-6（IL-6）多克隆抗体；即用型SABC免疫组化试剂盒；DAB浓缩显色试剂盒 （以上所有试剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供）。

1.4 分组与造模 将大鼠随机分为5组，即空白组、模型组、西药组、低剂量利咽解毒方组（简称低剂量组）和高剂量利咽解毒方组（简称高剂量组），每组10只。除空白组不予特殊处理外，其余4组实验组大鼠均予等剂量、等照射野和等源距的γ线照射。具体方法为：将大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉后，固定在自制的固定夹上，用开口器牵开口腔（口腔以外的部分用5 mm厚的自制铅板防护装置防护），用Co60远距离治疗机的γ射线行颊部左右对穿照射，源皮距为80 cm，每次2 Gy，每日1次，每周5次，总剂量均为46 Gy。照射结束后立即对颊部给予生理盐水湿润，最大化减轻对颊黏膜的影响，并把大鼠置于洁净的保温盒内待其自然苏醒。

1.5 给药方法 各组大鼠自造模前30 min用灌胃法给药1次，给药容量为10 mL/kg，每日3次，直至完成照射总剂量1周。空白组及模型组给予生理盐水，高剂量组给予高剂量利咽解毒方（2.1 g/kg），低剂量组给予低剂量利咽解毒方（1.1 g/kg），西药组给予西药混合液（生理盐水500 mL+利多卡因10 mL+庆大霉素8万单位+地塞米松5 mg+灭滴灵0.8 mg+小苏打2.0 mg）。

1.6 观察指标 （1）动物口腔黏膜的采集及观察。完成照射总剂量1周后将大鼠断颈处死，仔细解剖取下口腔颊部黏膜，在滤纸上铺平，借助放大镜取典型病变处组织，标本一分为二，一半用甲醛固定 12～24 h，石蜡包埋，制成5～6μm切片，作苏木精-伊红染色及免疫组化用；另一半立即置液氮内速冻，然后转移至-80℃冰箱保存备用。在光学显微镜下观察黏膜形态（黏膜上皮炎性细胞的多少，有无变性、坏死、溃疡形成以及成纤维细胞、新生血管等肉芽组织的增生情况）改变。光学显微镜下口腔黏膜损伤程度评分标准参照卫生部放射性口腔炎诊断标准（0级，口腔黏膜无炎性细胞、坏死、溃疡等；Ⅰ级，口腔黏膜中有少数炎性细胞，无坏死及溃疡；Ⅱ级，口腔黏膜有中量炎性细胞，无坏死及溃疡；Ⅲ级，口腔黏膜上皮固有层有大量炎性细胞浸润，小面积坏死，无明显溃疡；Ⅳ级，口腔黏膜大面积溃疡，有坏死组织，其周围有成纤维细胞、新生毛细血管等）。（2）免疫组化染色剂分析。对颊黏膜组织进行HE染色后，参照何迎春［7］免疫组化方法进行制片机染色等，摄像后，Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对图片进行分析，测定病变组织中HIF-1α、COX、IL-6的蛋白表达水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS16．0统计软件。计量资料以表示，采用多组均数比较的方差分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠口腔黏膜形态分级 大鼠急性ROM模型建立后，正常大鼠颊黏膜呈粉红色，表面湿润，物红肿溃疡。模型组大鼠接受照射第3周开始出现肉眼可见的红斑，黏膜下出现充血，随着放疗进行可看到溃疡加重，增多，并联合成片，纤维渗出，形成黄白色假膜，到放疗后第7日，所有受照射的部位形成片状溃疡。中药低剂量及高剂量组与西药组溃疡出现情况晚，放疗结束后逐渐开始出现，症状轻，放疗结束后第7日对各组大鼠颊黏膜形态进行光学显微镜观察，ROM分级情况见表1。

表1 各组大鼠放疗后颊黏膜形态分级（n）

2.2 各组大鼠急性ROM颊黏膜组织中HIF-1α、COX、IL-6表达的比较 见图1~图3，表2。正常组织不表达或很微弱表达HIF-1α、COX、IL-6，模型组颊黏膜组织及其间质可见大片或团状分布的棕黄色颗粒，低剂量组、高剂量组、西药组HIF-1α、COX、IL-6阳性表达细胞明显减少，均低于模型组（P＜0.05）。利咽解毒方低剂量及高剂量组与西药组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中低剂量组蛋白阳性表达均高于高剂量组（P＜0.05）。

图1 各组HIF-1α免疫组化染色光镜图（200倍）

图2 各组COX-2免疫组化染色光镜图（200倍）

图3 各组IL-6免疫组化染色光镜图（200倍）

表2 各组ROM颊黏膜组织HIF-1α、COX-2、IL-6表达水平

表2 各组ROM颊黏膜组织HIF-1α、COX-2、IL-6表达水平

与模型组比较，*P＜0.05；与西药组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05。

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3 讨 论

现代医学目前对急性ROM的防治没有统一的标准和特效药，虽取得了一定疗效，但长期疗效均不甚理想［7-11］。

急性 ROM 发病过程中，HIF-1α、COX、IL-6发挥了重要作用。有实验表明，HIF-1α在正常的颊黏膜组织中几乎不表达，而在ROM炎症组织中表达明显增强，说明HIF-1α参与了ROM的发病过程［12］。COX-2在正常颊黏膜组织中几乎不表达，而在ROM炎症组织中表达明显增强，在一定程度上体现着ROM病程的炎症状态［13］。IL-6是放射性损伤最主要的相关因子之一，它除对血管内皮细胞及炎症细胞具有直接地激活和毒性作用外，更主要是诱导急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反应和毒性作用，造成组织细胞的损害，其表达水平与炎性反应的严重程度有密切的相关性。实 验 研 究 证 明［17］，IL-6 与 ROM 关 系 密 切［14-15］， 抑 制IL-6的过量生成，可能会减轻免疫反应导致的上皮组织破坏。

中医学认为ROM属“口疮”、“口糜”等范畴，恶性肿瘤患者机体正虚邪实，瘀毒内结加之属火毒之邪的放射线，因此其病机关键为“虚”（气阴两虚）、“火”（实火、虚火）、“瘀”（气滞血瘀、气虚血瘀），虚、火、瘀三者互为因果，相互交结贯穿本病的始终，热毒之邪入血分，聚于局部，腐蚀血肉发为痈肿疮疡。利咽解毒方由虎杖、苦参、生地黄、山茱萸、射干、薄荷组成，旨在养阴清热、解毒利咽。方中生地黄清热凉血，养阴生津；苦参、虎杖清热解毒；射干、薄荷解毒利咽；山茱萸收敛创面，组方应用符合中医理论体系，贴近本病治疗实际，在临床上行之有效，而中医治疗ROM的机理研究鲜有报道。本实验结果显示各用药组HIF-1α、COX、IL-6表达较模型组均低，说明HIF-1α、COX、IL-6三者可能介导了急性ROM的发生发展过程，利咽解毒方通过减少组织间HIF-1α、COX、IL-6的表达发挥其抑制效应，其中利咽解毒方低剂量组和高剂量组又低于西药治疗组，说明利咽解毒方具有确切明显的抗炎疗效，且未发现毒副作用，可以作为治疗急性ROM的基础方用于临床，临症加减，提高放射性口腔黏膜炎的临床疗效。

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