灭幽汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证的机理研究*

王小娟 杜中华 喻 斌 郭建生△ 罗 燕 夏 蓉 尹 姣

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410007）

幽门螺杆菌相关性胃炎（HAG）在临床辨证分型中多表现为脾胃湿热证［1-4］。笔者的临床经验方——灭幽汤在治疗HAG脾胃湿热证方面取得了良好疗效，其功效为清热利湿、理气制酸止痛。本课题组对灭幽汤作了一系列的临床和实验研究［5-11］，在此基础上进一步探索灭幽汤的作用机理。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级8周龄BALB/c小鼠54只，雌雄各半，购自南京君科生物科技有限公司。实验动物质量合格证号 0017145，许可证号 SCXK（苏）2011-0003。

1.2 Hp菌种 悉尼标准菌株 （Sydney strain 1，SSI），SSI含有细胞毒素相关基因（cagA）蛋白和空泡细胞毒素（vacA），浓度为 Hp菌液 1×109cfu/mL，由湖南中医药大学基础医学院病原免疫学教研室提供。

1.3 药物 灭幽汤（黄芩、蒲公英、三七、白及、青皮、陈皮、乌贼骨）组方药材均购于湖南省药材公司饮片加工厂，经湖南中医药研究院鉴定，符合《中国药典》相关标准；药物浸泡30min后，加水没过药面5 cm，武火煎至沸腾后改文火，继续煎煮20min，取汁另置。继续加水，煎煮沸腾后，文火续煎20min，取汁。两次药汁合并后浓缩至每毫升含生药1 g，并用离心机去除药汁中残渣，4℃保存。枸橼酸铋钾由丽珠医药生产，批号1212248。替硝唑由山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司出厂，国药准字H20033090；克拉霉素由杭州中美华东制药有限公司出厂，国药准字H10970216。

1.4 仪器与试剂 HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅，上海南阳；LEICA DM LB2型双目显微镜，德国LEICA；Shandon325型石蜡切片机，英国Shandon；Motic B5显微摄像系统，麦克奥迪实业集团公司。台式冷冻离心机，eppendorf；荧光定量PCR仪、荧光PCR 板，Thermo；恒温水浴箱，J-MAX；旋涡混合器，其林贝尔；电泳仪、水平琼脂糖电泳槽，北京六一；-80℃冰箱，中科美菱；电动玻璃匀浆器，新芝；电子天平，民桥；精密pH计，雷磁。胶体金法幽门螺杆菌检测试剂盒，艾康生物技术（杭州）有限公司，生产批号201203139；TLR4抗体，武汉博士徳 （BA1717）；二抗试剂盒，北京中衫金桥（SP-9002） 逆转录试剂盒，Fermentas；EDTA、Tris、DEPC、E.B.，Sigma；Trizol，Invitrogen；Taq 酶 、DL2000 DNA Marker、dNTP，Genstar。 引物， 上海生工；SYBGREEN PCR Master Mix，ABI；IL-6 ELISA 检 测 试剂 盒 ，R&D公司（E-25764）。普通饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，高糖高脂饲料 （普通饲料+8%蜂蜜+12%猪油）由湖南斯莱克景达实验动物有限公司代加工。

1.5 分组与造模 将56只BALB/c小鼠按体质量分层后分为4组，每组14只，雌雄各半。空白组给予普通饲料常规饲养；模型组、灭幽汤组、胃三联组先给予高糖高脂饲料，自由饮水饲养10 d，于第11日放于温度（35±2）℃，湿度（95±1）%的人工湿热箱中，继续给予高糖高脂饲料，自由饮水。模型组、灭幽汤组、胃三联组均于第16日灌胃接种1×109cfu/mL浓度的Hp菌液0.3mL/只，灌胃前24 h禁食，4 h禁水；灌胃后禁食禁水2 h。隔日1次，连续接种3次。最后1次接种结束后，饲养条件维持不变，定植2周后以胶体金法检测血清Hp抗体，取胃黏膜做病理切片观察炎症情况，以及做电镜下观察Hp定植情况。

1.6 给药方法 造模成功后，分别给予灭幽汤组、胃三联组小鼠灌胃给药，模型组、空白组小鼠给予等量蒸馏水灌胃，每日1次。按照小鼠与人临床用药剂量、体型系数公式 dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3计算小鼠用药剂量，胃三联组小鼠用药剂量为279.8mg/kg，灭幽汤组用药剂量为12.4 g/kg。

1.7 标本采集与检测 2周后摘眼球取血，然后脱颈椎处死所有小鼠，迅速取出全胃，沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗干净后放入4%多聚甲醛中4℃固定24 h，石蜡包埋，切片。ELISA检测血清中白介素（IL）-6的含量，免疫组化法检测小鼠胃黏膜组织中TLR4的蛋白阳性表达，实时荧光定量PCR法检测小鼠胃黏膜组织中的TLR4基因的mRNA含量。（1）TLR4蛋白阳性表达：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min。0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）中微波炉加热修复抗原。 3%H2O2室温孵育 10min，PBS 冲洗，5min×3次。10%正常山羊血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，滴加浓度（1∶100）TLR4 的一抗，37 ℃孵育 2 h。 PBS冲洗，5min×3次。 滴加二抗（1%BSA-PBS 稀释），37℃孵育30min。PBS冲洗，5min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育30min。PBS冲洗，5min×3次。加入DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。使用CMIAS真彩色病理图像分析系统对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面密度（阳性表达总面积/统计区域总面积）表示，以此表示TLR4蛋白的表达，进行半定量分析。（2）TLR4基因的含量：提取胃黏膜组织总RNA。逆转录cDNA总体系20μL：组织中mRNA为模板进行逆转录反应，逆转录cDNA；反应条件：70℃加热 5min，37℃加热 5min，42℃加热 1.5 h；72℃反应10min。 TLR4 引物序列为 F：5′-CCTTTCAGGGAATTAAGCTCC-3′，R：5′-ACCGATGGACGTGTAAACCA-3′。qRT-PCR 反应体系总体积 30μL，反应条件：95℃10min，然后95℃ 5 s，54℃ 30 s，共40个循环。 采用相对定量比较actin基因与目标基因的Ct值，得出所测目标基因相对表达量。相对mRNA表达=2-△Ct×100%，△Ct值=靶基因Ct值-actin Ct值。结果由PCR仪配套软件计算。

1.8 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，符合正态性和方差齐性的资料，采用完全随机化设计的方差分析、多重比较，不符合正态性和方差齐性，用秩和检验Kruskal-WallisH检验，两组比较用 Wilcoxon检验和 Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠胃黏膜免疫组化结果 见图1。免疫组化图片中黄褐色区域为阳性表达。光镜下观察，空白组小鼠胃黏膜组织TLR4有极少量表达；模型组小鼠胃黏膜组织TLR4有大量阳性表达；灭幽汤组和胃三联组小鼠胃黏膜组织有少量TLR4阳性表达，明显少于模型组。

图1 各组小鼠胃黏膜组织TLR4免疫组化阳性表达

2.2 各组小鼠胃黏膜组织TLR4表达的比较 见表1。空白组小鼠胃黏膜组织中有极少量TLR4表达。与空白组比较，模型组小鼠胃黏膜TLR4表达增加，差异有显著统计学意义（P＜0.01），灭幽汤组与胃三联组小鼠胃黏膜TLR4蛋白表达增加，差异有显著统计学意义（P＜0.01），TLR4mRNA 表达增加，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，灭幽汤组与胃三联组小鼠胃黏膜TLR4表达降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；灭幽汤组与胃三联组相互比较，TLR4表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组小鼠胃黏膜组TLR4蛋白及其mRNA表达比较（±s）

表1 各组小鼠胃黏膜组TLR4蛋白及其mRNA表达比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。下同。

组 别 n TLR4蛋白（×10-3μm2） TLR4mRNA（×10-4）空白组 8 5.49±1.10 3.05±0.68模型组 8 78.83±19.66* 65.13±11.45*灭幽汤组 8 14.42±3.92*△ 12.50±6.40*△胃三联组 8 15.90±5.22*△ 15.23±7.75*△

2.3 各组小鼠血清IL-6表达的比较 见表2。空白组小鼠血清中有极少量IL-6表达。与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-6表达增加，差异有显著统计学意义（P＜0.01），灭幽汤组与胃三联组小鼠血清中IL-6表达增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，灭幽汤组与胃三联组小鼠血清中IL-6表达降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；灭幽汤组与胃三联组比较，血清中IL-6表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组小鼠血清IL-6比较（±s）

表2 各组小鼠血清IL-6比较（±s）

组 别 n IL-6（ng/L）空白组 8模型组 8灭幽汤组 8 10.60±0.56 38.16±5.26*11.01±1.45△胃三联组 811.56±1.54△

3 讨 论

HAG 属于中医学 “胃脘痛”、“痞满”、“嘈杂”、“泛酸”等病范畴。研究显示，慢性胃病脾胃湿热证的Hp感染率较高［12-14］，且Hp为致病生物因子符合现代湿热证成因的研究［15-16］。 Toll样受体（TLRs）是先天免疫反应中识别病原微生物并作出防御反应的重要受体，它能特异的识别病原体，介导跨膜信号转导并诱导活化免疫细胞而触发一系列的炎症反应［17］。TLR4是人类发现的第一个TLRs相关蛋白，其主要识别革兰阴性菌细胞膜上的脂多糖（LPS），而LPS本身并不造成机体的严重损害，它主要通过促使巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等释放大量的细胞因子，导致机体组织的损害。LPS主要与巨噬细胞表面的Toll4受体结合，最终启动TNF-α、IL-6等细胞因子基因的表达。

TLR4为巨噬细胞表面LPS的受体［18-20］，其表达的高低与细胞因子的释放具有直接的关系。幽门螺杆菌LPS可以诱导体内一些炎症因子如IL-6分泌的增加［21-22］，这可能与幽门螺杆菌 LPS 激活 TLR4/NF-κB传导通路有关［23-24］。细胞因子在介导和调节免疫应答及炎症反应过程中起到重要作用，而IL-6是重要的促炎因子之一，具有多种生物学功能，参与细胞免疫、炎症反应等过程，对炎症的发展起促进作用，并可致胃十二指肠黏膜的损伤［25］。

灭幽汤功效为清热利湿、理气制酸止痛，其中蒲公英、黄连、三七具有抗Hp的作用；陈皮、青皮均具有舒张胃肠道平滑肌作用，可有效缓解胃痛胀满等症状；乌贼骨具有中和胃酸作用，改善胃肠道环境从而影响Hp的生长环境达到辅助抗Hp保护胃黏膜的作用；青皮可改善胃肠血流量，白及具有胃肠道黏膜保护作用，协同三七共同促进损伤的黏膜修复。胃三联药物是通过杀灭Hp，在胃黏膜表面形成保护膜干预Hp的定植来治疗Hp相关性胃炎，而其他疗法不同之处在于使用PPI、H2受体阻滞剂或者中和胃酸制剂，其作用机理为抑制胃酸分泌或者中和胃酸保护胃黏膜，同时胃酸的减少改变了Hp的生长环境，从而达到抑制乃至杀灭Hp的目的。

本研究显示，模型组TLR4及下游炎症因子IL-6表达显著高于空白组，而经药物治后灭幽汤组、胃三联组表达显著降低，说明根除Hp后可以降低TLR4的表达，减少IL-6的产生。根据已知的胃三联药物作用机理和药理研究对中药组方灭幽汤的认识，推测灭幽汤治疗HAG脾胃湿热证的功效，其机理可能是通过抑制Hp生长，杀灭Hp，干预TLR4、IL-6的表达从而降低胃黏膜组织的炎性程度以达到治疗HAG脾胃湿热证的目的。

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