20（S）-原人参二醇诱导U87细胞凋亡的机理研究*

南一楠 李 娇 李澎涛 华 茜△

（1．北京中医药大学基础医学院，北京 100029；2．北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

脑恶性胶质瘤是中枢神经系统中常见的原发性肿瘤，约占原发性中枢神经系统肿瘤的40%～53%［1］。原人参二醇（PPD）是存在于人参和三七中的达玛烷型四环萜烯皂角苷［2-3］。 20（S）-原人参二醇（aPPD）是人参皂苷经过胃肠道菌群去糖代谢活化后产生的活性成分，具有广谱抗肿瘤作用。本研究观察aPPD对人胶质瘤细胞U87的抑制杀伤作用，探寻其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 细胞培养 人脑胶质瘤细胞U87购置于ATCC，培养在含有 10%胎牛血清（FBS，Gibco，NY）的 DMEM（Sigma）中，并加入青霉素和链霉素（Gibco-BRL，NY）防治细菌感染。于5%CO2培养箱内培养，温度为37℃。细胞达到80%密度时传代，约3～4 d传1代，40代之前的细胞用于实验。

1．2 药物与试剂 原人参二醇受赠于Pegasus制药公司（Vancouver，BC），存储液用纯乙醇配制，浓度为80mmol/L，于4℃避光保存。使用时溶解于完全培养基内，配制成所需终浓度。一抗anti-pro-caspase3（ab cam，ab47131，US）和 anti-PARP （Proteintech，13371-1-AP，US）均按 1∶1000稀释， 溶解于 3%BSA的TBST中，4℃孵育过夜。

1．3 细胞活力检测（MTS法） U87细胞接种于96孔板上，接种密度为每孔 2．5×104个，100 μL 每孔。 接种24 h后吸去培养基，重新添加新的含药培养基。作用指定时间后，向每孔中加入20μLCellTiter 96 AQueous One Solution Reagent（Promega），于 5%CO2，37 ℃培养箱中孵育1～4 h，之后于490 nm处测量吸光度值，数值越大说明细胞活力越强。

1．4 蛋白提取与免疫印迹 药物作用到指定药物作用时间后，吸去培养基，用预冷的PBS轻轻清洗细胞表面1次，之后加入上样缓冲液 ［62．5mmol/L Tris-HCl，2%SDS，10%甘油，50mmol/LDTT，0．01%（w/v）溴酚蓝］，用细胞刮轻轻将裂解产物刮下，转入离心管内99℃加热5min，之后离心，待蛋白冷却后即可上样。等量的蛋白上样于SDS-PAGE胶上，待蛋白根据分子量大小分离开后进行转膜 （BIO-RAD），采用NC膜，100 V转1.5 h后将膜取出，于5%脱脂牛奶中封闭1 h后加入一抗4℃孵育过夜。次日吸走一抗，将膜用TBST洗3遍，每遍15min。之后选择相应二抗进行孵育，室温在摇床上孵育1 h，同样用TBST清洗3遍，15 min每次。采用 ECL显影液 （Perkin-Elmer Life Sciences，Boston，MA）进行检测，拍摄图像后用 Image J进行分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用 One-way ANOVA 比较。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTS法检测结果 见表1。用不同浓度的aPPD处理U87细胞，24 h后用MTS法检测细胞活力，结果发现10μmol/L浓度的aPPD即对U87细胞有显著的抑制作用，且随aPPD浓度升高抑制作用愈明显（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 不同浓度aPPD作用U87细胞24h后的MTS测定结果（±s）

表1 不同浓度aPPD作用U87细胞24h后的MTS测定结果（±s）

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

aPPD剂量 n 0μmol/L（对照组） 3 10μmol/L 3 20μmol/L 3吸光度值2.32±0.12 1.84±0.08**1.47±0.06**40 μmol/L 3 1.04±0.07**60 μmol/L 3 1.05±0.16**80 μmol/L 3 0.72±0.10**

2.2 免疫印迹检测结果 不同浓度的aPPD作用于U87细胞后8 h，免疫印迹结果显示pro-caspase3随aPPD浓度升高呈逐渐减少趋势 （图1）。利用Image J进行定量分析其条带光密度与β-actin的比值，结果可知40μmol/L以上浓度的aPPD会使pro-caspase3含量明显下降（表2）。免疫印迹结果也发现PARP有切割条带的产生（图2），说明当U87收到aPPD作用时，其细胞内部的caspase3被激活。

图1 不同浓度aPPD作用于U87细胞8h后pro-caspase3的变化

3 讨 论

大量研究发现，PPD及其衍生物对多种肿瘤细胞具有杀伤性，并且对正常组织细胞无害［4-6］。aPPD对肝癌、肺癌以及黑色素瘤细胞具有明显的生长抑制和杀伤作用［7］，并且能够诱导骨髓瘤细胞的凋亡，治疗白血病［8］。

表2 aPPD作用于U87细胞8 h后pro-caspase3的变化情况（±s）

表2 aPPD作用于U87细胞8 h后pro-caspase3的变化情况（±s）

aPPD剂量 n 0μmol/L（对照组） 3 10μmol/L 3 20μmol/L 3 pro-caspase3/actin 1.00±0.00 0.95±0.13 0.90±0.10 40 μmol/L 3 0.74±0.12*60 μmol/L 3 0.64±0.17**80 μmol/L 3 0.51±0.04**

图2 不同浓度aPPD作用U87细胞后PARP的表达变化

关于其机制研究也广泛展开，一项在体研究表明，20（S）-PPD对肝癌大鼠模型具有显著疗效，能够抑制肿瘤内部新生血管形成，降低微血管密度，并促进其凋亡［9］，其分子机制可能与抑制肿瘤组织血管内皮生长因子的表达有关［10］；另一方面，它还能提高小鼠特异性和非特异性免疫功能［11］。有研究表明，Rh2的作用机制主要为 caspase 家族的激活［6，12］，Rh2 还与活性氧生成和 p21 活力有关［13-14］。

20（S）-PPD具有与Rh2相似的化学结构，其杀伤肿瘤的作用机制尚未完全明确，因此笔者猜想其也有可能与caspase3的激活有关。caspase家族是一类存在于细胞内的半胱氨酸蛋白酶，可以切割肽链上天冬氨酸之后的肽键，具有高度的特异性［15］。它们广泛参与细胞凋亡的各个过程，因此越来越多地在肿瘤治疗领域受到关注。包含凋亡起始者（caspase2、8、10）和凋亡执行者（caspase3、6、7），caspase3 和 caspase7 具有相似的底物［16］，会降解 PARP、DFF-45 等，导致 DNA 修复抑制以及降解，进而导致细胞凋亡［17］。

细胞活力实验结果显示，aPPD对胶质瘤细胞具有较好的杀伤作用，免疫印迹结果证明caspase3前体随aPPD浓度增高而减少，具有明显的相关性。而caspase3常见的底物PARP也被切割，说明U87细胞内caspase3被aPPD诱导激活，从而进入凋亡状态。

本研究发现aPPD诱导U87细胞凋亡的途径可能与caspase3的激活有关，然而天然提取物往往具有多靶点、多通道的作用机制，aPPD是否还具有其他杀伤肿瘤细胞的作用途径，其如何激活caspase3等问题，尚待进一步深入研究。

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