心之络病“孙络疏失”模型大鼠心肌组织病理变化研究*

张俊修 霍 旺 王 朋 李绍旦 刘 毅 杨明会

（中国人民解放军总医院，北京 100853）

人体经络系统由经脉和络脉组成，其中络脉包括“十五络脉”和难以计数的浮络、孙络等［1］。络脉功能正常对维持心脏正常生理功能有重要作用。本研究从孙络着手探寻络脉病变对心脏的影响，通过建立大鼠“孙络疏失”模型，多方面探讨心之络病“孙络疏失”模型下心肌组织病理变化特征，为孙络病变对心脏的影响提供病理学支持，进而从整体论述孙络病变在 “心之络病”中的重要意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（220±20）g，购自军事医学科学院动物中心，动物许可证号：SCXK-（军）2012-0004。按每笼5只饲养于独立通气笼具系统内，温度（22±1）℃，湿度（50±5）%，每日光照与黑夜时间各12 h。实验期间造模、取材等操作均在超净工作台内进行，添加饲料、换水等由专人负责管理。

1.2 主要试剂 乌拉坦 （国药集团化学试剂有限公司，批号T2011110）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号F3047216）；4%多聚甲醛（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号AR-0211）；50%戊二醛（国药集团化学试剂有限公司，批号20111215）。

1.3 主要仪器 电子秤 （长沙湘平科技发展有限公司，EPS-2001）；小动物心电图机（北京福田电子医疗仪器有限公司，FX-211）；动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司，ALC-V9）；超净工作台（北京长城空气净化工程公司）；光学显微镜（CH-2，日本Olympus公司）；多功能显微镜带相机（FDX-35，日本Nikon公司）；透射电子显微镜（H-7650，日本日立公司）；超薄切片机（UCT，德国莱卡公司）。

1.4 造模及分组 选取心电图正常大鼠30只，按随机数字表法分成假手术组、造模30min组、造模1 h组、造模6 h组、造模12 h组和造模24 h组。“孙络疏失”大鼠模型造模参照文献［2］，大鼠以20%乌拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，经口气管插管连接呼吸机，设定呼吸频率 80 次/min、潮气量 15mL/kg、呼吸比 1∶1。于大鼠左侧胸壁3～4肋间横向开胸，暴露心脏，撕开心包膜，在冠状动脉左侧主干处，左心耳下方约2～3mm处以左心耳与肺动脉圆锥间左冠状静脉主干为标志结扎（假手术组只穿线，不接扎），进针深度约1～1.5mm，宽约2.0mm，逐层关闭胸腔，待大鼠自主呼吸恢复后，移除呼吸机。以室壁运动减弱，结扎下部心肌组织颜色变白，心电图可见胸前各个导联的sT段抬高、T波高耸为造模成功标志。造模后每只大鼠一次性注射青霉素钠40万U预防感染。

1.5 标本采集与处理 （1）HE染色。各组大鼠于规定时间点以20%乌拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，经颈动脉插管，以4%多聚甲醛心脏灌注，灌注结束后摘取心脏，10%甲醛溶液固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制备石蜡切片，超薄切片机切片，切片厚度5μm。行常规HE染色：石蜡切片常规脱蜡水化，苏木素液染色，1%盐酸乙醇分化，返蓝，乙醇伊红染色，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察组织结构并拍照。（2）电镜。各组大鼠于规定时间点以20%乌拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，迅速摘取心脏，冰浴下于左心室游离壁（梗死区）及右心室（非梗死区）各取一块组织［3］，每块体积1mm×1mm×2mm，将组织块固定于2.5%戊二醛中2 h，经磷酸缓冲液冲洗后，1%锇酸后固定1 h，经丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，片厚约70 nm，先后经枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色，透射电镜下观察。

2 结 果

2.1 HE染色观察结果 假手术组心肌纤维排列规则，横纹清晰，心肌细胞核居中，未见组织坏死、血管扩张及炎性细胞浸润，无纤维疤痕组织增生。造模30min组心肌组织内可见炎性细胞浸润及心肌细胞坏死溶解样改变；造模1 h组，心肌组织内可见炎性细胞浸润及心肌细胞坏死溶解样改变。造模6 h组心肌组织内可见大量炎性细胞浸润，心肌细胞坏死溶解增多，心肌边缘形态破坏。造模12 h组心肌组织内可见大量炎性细胞浸润，心肌细胞斑片状坏死溶解，心肌边缘形态破坏，开始出现纤维组织增生样改变。造模24 h，心肌组织内可见心肌细胞坏死溶解，心肌边缘形态破坏，继续出现细胞增生样改变，炎性细胞浸润此时已不明显。各模型组非梗死区表现正常。见图1。

图1 各组大鼠心肌HE染色切片形态学改变（光镜，20倍）

2.2 透射电子显微镜观察结果 （1）假手术组：心肌细胞肌膜完整，核多呈不规则形，位于细胞中央，染色质分布均匀，核膜完整，核周间隙正常（图2A），肌原纤维排列整齐，肌节、Z线和M线清楚，闰盘结构完整清晰，线粒体和糖原颗粒丰富，线粒体结构大多正常，偶见轻度肿胀。间质血管结构正常，未见明显淤血，内皮细胞可见一定数量吞饮小泡，细胞间连接清晰，亦未见炎性细胞浸润（图3A）。（2）造模30min组：梗死区心肌细胞肌膜尚完整，但呈轻度指状突起，细胞核形态和染色质基本正常，核膜完整，核周间隙轻度增宽 （图2B），肌原纤维排列基本整齐，然Z线和M线可见迂曲模糊，闰盘局灶性模糊，线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴排列紊乱，糖原颗粒轻度减少。间质血管结构正常，部分内皮细胞间连接模糊（图3B），间质未见炎性细胞浸润，非梗死区仅见线粒体轻度肿胀。（3）造模1 h组：梗死区心肌细胞肌膜尚完整，可见肌膜下水肿或指状突起，心肌细胞水肿，核内染色质稀疏，核膜模糊，核周间隙增宽 （图2C），肌原纤维排列紊乱或间隙增宽，Z线和M线模糊，可见肌原纤维轻度灶性溶解，闰盘局灶性模糊，线粒体轻至中度肿胀，线粒体嵴断裂或排列紊乱，糖原颗粒明显减少。间质血管结构正常，然内皮细胞膜、胞内细胞器结构及细胞间连接模糊（图3C），间质未见炎性细胞浸润。非梗死区未出现细胞退变及内皮细胞损伤改变，线粒体肿胀和肌膜下水肿较多见。（4）造模6 h组：梗死区心肌细胞肌膜指状突起及髓鞘样结构形成，甚至出现肌膜破裂，心肌细胞核膜局灶性模糊，假包含体形成，甚至出现核膜破裂，细胞坏死（图2D），肌原纤维排列紊乱，Z线和M线模糊且排列紊乱，可见肌原纤维灶性溶解，闰盘局灶性模糊，线粒体轻至中度肿胀，线粒体嵴断裂或排列紊乱，髓鞘样结构形成，糖原颗粒明显减少，脂滴增多。间质血管内皮细胞凋亡，细胞间连接模糊，基底膜断裂，并可见单核细胞、淋巴细胞等炎细胞浸润（图3D）。非梗死区仅见线粒体及肌纤维病理性改变。（5）造模12 h组：梗死区心肌细胞肌膜指状突起及肌膜下明显水肿，甚至出现肌膜破裂；心肌细胞核膜模糊，假包含体增多，核周间隙增宽，核膜破裂、核碎裂甚至溶解（图2E），肌原纤维断裂溶解增多，Z线和闰盘模糊、断裂，线粒体明显肿胀，线粒体嵴断裂或排列紊乱甚至空化，糖原颗粒明显减少。间质血管血管内皮细胞坏死、凋亡，细胞间连接模糊，吞饮小泡增多（图3E），并可见单核细胞、淋巴细胞等炎细胞侵润，非梗死区未见坏死及凋亡改变。（6）造模24 h组：梗死区心肌细胞肌膜指状突起及肌膜下水肿持续存在，但有所减轻，心肌细胞核膜局灶性模糊，核周间隙增宽，核染色质凝集边移呈凋亡或细胞坏死或细胞退变持续存在（图2F），肌原纤维排列紊乱或呈波浪状排列，Z线和M线模糊且排列紊乱，肌原纤维灶性溶解减少，闰盘局灶性模糊，糖原颗粒明显减少仍存在，线粒体轻至中度肿胀，部分线粒体密度增高。间质血管血管内皮细胞仍可见坏死、凋亡，细胞间连接模糊，吞饮小泡增多（图3F）。非梗死区未见坏死及凋亡改变。

图2 各模型组大鼠心肌梗死区心肌细胞超微结构变化（电镜，4000 倍）

3 讨 论

3.1 “孙络疏失”模型 “孙络疏失”是基于“脉络-血管系统病”理论提出的新概念。中医学认为，孙络是人体络脉的最小单位，对应现代医学的小血管、微血管，孙络与微循环在结构分布、生理功能、病理变化等方面具有同一性［4］。“孙络疏失”的病变基础在微循环，“疏”指数量的减少，“失”是“疏”的进一步加重，造成了小范围内的孙络消失，同时“疏失”也指功能的缺失。大鼠冠状动脉前降支结扎制作的心肌缺血模型，已被证实其微血管密度降低［5］，正与“孙络疏失”相对应，而孙络渗灌气血、濡养脏腑的功能受损，会导致“心主血脉”一系列正常生理功能受损，与心肌梗死后心功能各项指标的异常表现相一致［6］。因此选择结扎大鼠冠状动脉前降支的方法来制作心之络病“孙络疏失”的大鼠模型。

3.2 “孙络疏失”模型大鼠心肌组织病理变化 HE染色显示，各模型组均存在不同程度的病理改变，30min及1 h以炎性细胞浸润和部分心肌细胞坏死为主要改变，6 h炎性细胞浸润最明显并伴有心肌细胞坏死溶解改变，12 h和24 h以心肌组织内增生改变为主，且24 h炎性细胞浸润不明显，病理变化逐渐由炎性细胞浸润的轻度改变向心肌细胞坏死改变发展，在24 h内可以连续观察到此种变化，说明在“孙络疏失”急性期，由于孙络在数量和功能上的减少和降低，导致“心失所养”，产生了心肌组织一系列病理变化，提示孙络是维持正常心肌组织结构不可缺少的重要因素。

心肌细胞超微结构的改变是反映细胞损伤最直观的指标。线粒体是维持细胞能量的功能单位，与细胞功能有密切关系。心肌线粒体较多，紧贴肌原纤维。当心肌缺血时，心肌线粒体出现形态结构上的变化，直接影响对心肌能量的供应［7］。本研究显示，各模型组线粒体不同程度的肿胀，线粒体嵴断裂或排列紊乱，髓鞘样结构形成，糖原颗粒明显减少，表明线粒体功能障碍，而Z线和M线迂曲模糊，闰盘模糊，肌原纤维灶性溶解，心肌细胞水肿及心肌细胞坏死的出现，都说明在“孙络疏失”急性期心肌细胞的结构和功能都受到了极大的破坏。在心肌组织中，存在着大量微血管起到维持血液正常流态、调节微血管张力以及血管内外营养物质交换等作用，微血管结构的完整性是生理功能得以发挥的重要基础［8］。本研究结果显示，微血管内皮细胞病变涉及血管内皮细胞膜、胞内细胞器结构及细胞间连接模糊、血管间质内皮细胞凋亡等病理变化，微血管结构的破坏导致其功能的丧失，进一步加重了心肌细胞功能的丧失，最终造成心肌梗死区的形成及其功能的减弱，而“孙络疏失”是产生这些病理改变的根本原因。

综上所述，在“孙络疏失”急性期，孙络的缺失，导致心肌组织产生了广泛的病理变化。依据“脉络-血管系统病”理论［9］，孙络作为人体经脉系统最末端结构与现代医学小血管、微血管特别是微循环具有同一性，二者在结构分布、生理功能、病理变化等方面均具有密切相关性［4］，说明孙络是心肌组织的一部分，“孙络疏失”作为直接因素影响心肌组织的结构和功能，同时由于其功能的丧失，作为间接因素同样影响着心肌组织的结构和功能。所以，孙络对维持心肌正常结构功能起着不可替代的作用，而从孙络着手治疗心系疾病，值得进一步研究。

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