对小干扰RNA长期作用HBV转基因小鼠抑制乙肝病毒复制的评价①

张卫云 孙朝晖 任广立 石玉玲 李 薇 张 蓉 唐荣芝(广州军区广州总医院检验科，广州510010)

对小干扰RNA长期作用HBV转基因小鼠抑制乙肝病毒复制的评价①

张卫云 孙朝晖 任广立②石玉玲 李 薇 张 蓉 唐荣芝(广州军区广州总医院检验科，广州510010)

目的:探讨小干扰RNA长期作用HBV转基因小鼠对抑制乙肝病毒复制的评价。方法:siRNA表达载体经尾静脉注射转染HBV转基因小鼠，设立特异性 siRNA组(pSilencer5.1/C2、pSilencer4.1/C2、pSilencer3.1/C2)、PBS对照组和阴性质粒对照组(n=10)。在注射后第6天、21天、1个月、3个月、6个月和9个月的不同时间经其内眦静脉采血，采用化学发光法定量检测小鼠血清中HBsAg水平，实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA水平。结果:siRNA长期作用机体可使转基因小鼠血清HBsAg和HBV-DNA水平显著降低，特异性siRNA组与PBS对照组相比，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。而阴性质粒对照组与PBS组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:基于载体的特异性siRNA长期作用HBV转基因小鼠可抑制HBV的复制和表达，该抑制作用是特异性的。

小干扰RNA;HBV转基因小鼠;乙肝病毒

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成为严重威胁全球健康的主要问题之一，目前全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者已超过4亿，约有15% ～25%的感染者最终可能死于HBV相关疾病，每年有100万人死于HBV感染所导致的肝硬化、重型肝炎及肝细胞癌等。中国是HBV感染的高发地区，HBV乙肝表面抗原携带者占全国人口的10% ～15%。目前，针对慢性乙肝肝炎的抗病毒治疗主要采用重组干扰素和以拉米夫定和阿德福韦为代表的核苷类似物，但是迄今为止，其治疗效果却不能让人满意，并伴有严重的副作用，停药后的反弹和耐药株的出现仍然是亟待解决的难题。反义核酸、核酶的研究开启了基因治疗HBV感染的序幕，虽然目前这些基因治疗技术仍不能彻底清除HBV病毒，但作为基因治疗之一的RNAi已被证实是一非常有开发前景的抗HBV治疗手段之一[1，2]。因此，本文用 siRNA 表达载体经微静脉长期注射HBV转基因小鼠，观察小鼠HB-sAg浓度和乙肝病毒复制水平的变化，评价小干扰RNA(siRNA)对乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 HBV全基因转基因小鼠50只，购自解放军第458医院全军传染病中心。小鼠体重(20±2)g，8～10周龄，雌雄分笼，运至本实验室后置于相对清洁环境饲养，稳定2周后再进行实验。分为特异性 siRNA 组(pSilencer5.1/C2、pSilencer 4.1/C2、pSilencer3.1/C2)、阴性质粒对照组和 PBS对照组，每组10只小鼠。

1.2 载体和主要试剂 从既往研究构建的载体[3-5]中选择 pSilencer5.1/C2、pSilencer 4.1/C2组、pSilencer 3.1/C2三种载体;小鼠血清HBsAg抗原定量检测用化学发光微粒子免疫检测法，仪器为雅培Abbott i2000 SR全自动化学发光仪及原装试剂。HBV-DNA定量检测采用罗氏(LightCycler 480)实时荧光定量扩增仪，试剂为上海科华有限公司生产的HBV-DNA定量试剂盒。使用罗氏(LightCycler 480) PCR分析仪方法实时荧光PCR技术进行定量检测，采用中山大学达安基因试剂盒进行定量聚合酶链反应(PCR)检测。

1.3 方法 参照文献[6，7]采用高压水尾静脉注射法将既往构建的siRNA表达载体按5 mg/kg给药，按小鼠体重的8%注入，均以PBS(1.5～2.0 ml)稀释，10 s左右注射完成。在注射后6 d、21 d、1个月、3个月、6个月、9个月通过小鼠内眦静脉采血，使用上述方法检测HBsAg(U/ml)浓度和HBV-DNA定量拷贝数，计算出 HBsAg的抑制率，抑制率= (NPBS对照组－N实验组)/NPBS对照组×100%。

2 结果

2.1 不同载体长期作用HBV转基因小鼠对HBsAg浓度的影响 siRNA载体转染HBV转基因小鼠后，在治疗6 d、21 d、1 月、3 月、6 月、9 月采血检测小鼠血清中的HBsAg浓度，结果发现在治疗的第6天特异性siRNA组与PBS对照组相比HBsAg浓度显著

降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，至第21天时基本稳定于一较低水平表达，直到观测的第9个月HBsAg浓度无明显改变;而阴性对照组对HBV转基因小鼠HBsAg水平无任何抑制作用。同时研究发现特异性siRNA组抑制效应在pSilencer5.1/C2载体最为明显，pSilencer5.1/C2、pSilencer4.1/C2、pSilencer 3.1/C2对HBsAg的抑制效率在9个月时分别为 (92.80 ±0.93)%、(90.02 ± 0.92)%、(85.62 ±0.88)%，见表1。

2.2 转染了siRNA载体的HBV转基因小鼠血清的HBV-DNA水平 对转染了siRNA载体的HBV转基因小鼠在治疗后上述同样时间采血检测小鼠血清中的HBV-DNA水平，结果发现在治疗的第6天特异性siRNA组与PBS对照组相比HBV-DNA浓度显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，而阴性对照组对HBV转基因小鼠HBV-DNA水平无任何抑制作用。其中在特异性siRNA组中，以pSilencer5.1/ C2载体对HBV-DNA的抑制最显著，其次pSilencer4.1/C2 稍强于 pSilencer3.1/C2，见图 1。

图1 不同载体长期作用HBV转基因小鼠血清中HBVDNA浓度Fig.1 Long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice HBV-DNA serum concentration

表1 不同载体长期作用HBV转基因小鼠血清中HBsAg浓度(U/ml，n=10)Tab.1 Long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice of HBsAg serum concentration(U/ml，n=10)

3 讨论

RNAi是保守的进化机制，有利于对抗外来基因的入侵如病毒和转座子等，是基因水平的抗病毒免疫机制，同时还参与自身基因表达的调控[8，9]。小非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一类内源性、约21-25 nt长的 miRNAs(microRNA)或siRNAs，具有稳定的特异性序列以调节基因表达。这些RNA分子虽然很小，却在基因表达的调控中扮演了重要的角色。目前在真核细胞内，siRNA的来源主要有两种:一种是化学合成的 siRNA，操作简单，但作用时间短、成本昂贵;另一种是构建 siRNA表达质粒，它可以在细胞内转录成短的发夹状 shRNA，可以产生与化学合成的siRNA同样的沉默效应，并且作用持久。siRNA不仅是一种研究基因功能的有力工具，而且在抗病毒复制方面具有很高的药物开发价值[10，11]。

本实验表明在特异性siRNA长期作用下HBV转基因小鼠HBsAg浓度和乙肝病毒复制均被有效抑制，且与对照组有显著性差异(P＜0.05)，其中pSilencer5.1/C2对病毒的抑制效率最高，因为pSilencer5.1/C2载体是一种基于逆转录病毒和聚合酶Ⅲ的双启动子表达载体，它既可以经反转录病毒包装细胞系统达到siRNA的传输，也可以由聚合酶Ⅲ启动子介导高水平的siRNA传输。pSilencer4.1/C2较高于pSilencer3.1/C2，这与不同载体的驱动子类型密切相关，pSilencer4.1/C2基于 Pol II的表达载体，pSilencer3.1/C2载体是基于聚合酶Ⅲ，研究发现PolⅡ可能在真核细胞的转录调控中起非常重要的作用，能够介导有效的 siRNA合成和较强的RNAi效应，尤其对在体水平的调控，它可能主要负责体内mRNA转录。PolⅡ启动子所驱动的siRNA表达同样可以与PolⅢ启动子驱动的siRNA表达相当，且不会引起非靶向效应的产生[12]。因此从长期抑制效果来看 pSilencer5.1/C2较 pSilencer4.1/C2和pSilencer3.1/C2来说是较为理想的抑制载体。

总之，特异性siRNA可以有效的抑制HBV的复制和表达，但siRNA对已存在的HBVCCCDNA没有作用[13]，彻底清除 HBV尚有一定的困难，因此，加强病毒性肝炎的预防及探求慢性肝炎的有效治疗方法，仍是当前亟待解决的重大课题。

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[收稿2013-10-10 修回2013-11-18]

(编辑 倪 鹏)

Evaluation of long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice on inhibit replication of hepatitis B virus

ZHANG Wei-Yun，SUN Zhao-Hui，REN Guang-Li，SHI Yu-Ling，LI Wei，ZANG Rong，TANG Rong-Zhi.Department of Clinical Laboratory，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangzhou 510010，China

Objective:To investigation of the long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice on inhibit replication of hepatitis B virus.MethodsThe constructed siRNA expressed vectors was transfected HBV transgene mice by hydrodynamics-based injection via vena caudalis.Different groups were set including:specificity siRNA groups(pSilencer5.1/C2，pSilencer4.1/C2，pSilencer3.1/C2)，PBS group and negative vector group(n=10).The effect was observed in different periods(6 d，21 d，1 months，3 months，6 months and 9 months after injection).HBsAg was analyzed by Chemiluminescence method，HBV-DNA was analyzed by real time quantitative PCR(RQ-PCR).ResultsCompared with the PBS group，specificity siRNA groups showed decreased levels of HBsAg and HBV-DNA(P ＜0.05).Negative vector group did not show such changes，there were no significant differences(P ＞0.05).ConclusionThe siRNA based on the expression vector can suppress the expression and replication of HBV in HBV transgene mice.The inhibition effects of long-term-siRNA treatment was specific.

siRNA;HBV transgene mice;Hepatitis B virus

R392.7

A

1000-484X(2014)05-0666-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.021

①本文为广东省医学科研基金(A2012444)。

②广州军区广州总医院儿科，广州510010。

张卫云(1978年－)，女，主管技师，主要从事临床免疫学方面研究，E-mail:1261349825@qq.com。