基于Keap1-Nrf2-ARE探讨强直性脊柱炎患者心功能降低的机制①

齐亚军 刘 健 郑 力 万 磊 曹云祥 孙 玥 王 芳(安徽中医药大学研究生部，合肥230038)

基于Keap1-Nrf2-ARE探讨强直性脊柱炎患者心功能降低的机制①

齐亚军 刘 健②郑 力③万 磊②曹云祥②孙 玥 王 芳(安徽中医药大学研究生部，合肥230038)

目的:基于Keap1-Nrf2-ARE通路探讨强直性脊柱炎(AS)患者心功能降低的机制。方法:随机选取140例AS患者作为研究组，并抽取60例健康人作为正常对照组;采用多普勒超声心动图(UCG)检测两组心功能参数[E峰、A峰、E/A比值、左心房舒张期内径(LADd)、左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室射血分数(EF)、每搏输出量(SV)];采用ELISA法检测两组血清中通路蛋白[Keap1样ECH相关蛋白l(Keap1)、核因子NF-E2相关因子(Nrf2)]、氧化应激指标[丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(TAOC)]和细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10)含量;采用魏氏法检测炎性指标血沉(ESR);采用日立7060型全自动生化分析仪检测C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白。结果:(1)与正常对照组相比，AS活动期心功能参数(E峰、EF、E/A 值)、抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)值均显著降低(P＜0.01或 P＜0.05);心功能参数 A 峰、通路蛋白(Keap1、Nrf2 值)、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指标(ESR、CRP)值显著升高(P＜0.01或P＜0.05)。(2)与正常对照组相比，AS稳定期心功能参数[E峰、E/A值]、抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)值均显著降低(P＜0.01或 P＜0.05);心功能参数 A峰、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(TNF-α)、炎性指标(ESR、CRP)值显著升高(P ＜0.01 或 P ＜0.05)。(3)与 AS稳定期相比，AS活动期心功能参数(E峰、EF、E/A值)、抗氧化指标(SOD、TAOC)、细胞因子(IL-10)值均显著降低(P＜0.01或P ＜0.05);通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指标(ESR、CRP)、AS临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值显著升高(P ＜0.01 或 P ＜0.05)。(4)与 AS 患者 Keap1、Nrf2正常组比较，Keap1、Nrf2异常组心功能参数A峰显著升高，E峰、E/A值显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。(5)相关性分析显示，心功能参数E峰与抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈正相关，与通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指标(ESR、CRP)、AS 临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、免疫球蛋白 G(IgG)、病程呈负相关;心功能参数 A峰与通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS临床评价指标、心悸症状呈正相关，与通路蛋白 Keap1、抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈负相关;心功能参数 E/A比值与抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈正相关，与氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(TNF-α)、AS临床评价指标、病程呈负相关;心功能参数EF与病程呈负相关;心功能参数FS与通路蛋白Keap1呈负相关(P＜0.05)。结论:33.56%的AS患者存在心功能降低，表现为心功能参数E峰、E/A值显著降低，A峰显著升高;心功能参数E峰、E/A值均与抗氧化指标、抑炎细胞因子呈正相关，与通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指标、致炎细胞因子、炎症指标呈负相关;而心功能参数A峰与通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指标、致炎细胞因子呈正相关，与抗氧化指标、抑炎细胞因子呈负相关。Keap1、Nrf2表达上升，Keap1-Nrf2-ARE信号通路活化后，机体抗氧化能力下降，促使细胞因子失衡、炎症指标升高，导致免疫复合物异常沉积增多，在引起AS发病的同时出现心功能降低。

强直性脊柱炎;心功能;Keap1;Nrf2;氧化应激

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性、进行性、自身免疫性疾病，其病变并非局限于关节，多引起关节以外的结缔组织的病变。心血管系统因富含丰富的结缔组织与血管，很容易受累。前瞻性研究表明AS相关的心血管疾病的发生率为10% ～30%[1]，显著高于普通人心血管疾病的发生率[2]。一般认为其发病与感染、遗传和免疫有关，但确切发病机制至今尚未明确。近年来，研究表明氧化应激(Oxidative stress，OS)可能参与AS相关的心血管疾病病理过程，在其发生、发展中起重要作用。

研究发现，核因子 NF-E2相关因子(Nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)通过与抗氧化反应元件(Antioxidant response element，ARE)相互作用调节编码抗氧化蛋白，是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路[3]。Keap1样ECH相关蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)-Nrf2/ARE作为机体内有效的抗氧化调节通路，对于防御、减轻氧化应激对人体的危害起着举足轻重的作用[4]。

Nrf2广泛存在于多种组织和细胞中，在调节氧化应激反应中起重要作用。正常情况下，Keap1将Nrf2以二聚体形式锚定于胞浆，促使胞浆内Nrf2持续泛素化并被蛋白酶不断降解，从而抑制Nrf2激活[5]。应激状态下，活性氧、活性氮和内外源性电子激活剂可氧化Keap1上的巯基或磷酸化Nrf2分子中的丝氨酸和苏氨酸残基，从而改变Keap1或Nrf2空间构象，抑制Keap1活性，导致Nrf2与Keap1分离，向细胞核内转移;在核内，Nrf2与小分子Maf蛋白结合形成二聚体，然后再与ARE结合，启动下游抗氧化酶基因及II相解毒酶基因转录，从而调节细胞氧化还原状态，抵抗氧化应激和其他毒性损伤，实现其抗氧化和解毒作用[6-8]。Keap1-Nrf2-ARE信号通路的活化，是机体对环境毒物的一种应激防御反应能力的体现。

国外诸多医家研究表明氧化水平升高和抗氧化能力下降可能与AS的发病有关，但AS关节外病变心功能的变化是否与氧化应激紊乱有关?迄今为止未见相关文献报道[9-20]。Keap1-Nrf2/ARE作为机体内最为重要的内源性抗氧化应激通路，在AS心功能损伤中扮演着何种角色?尚不清楚。故本次研究我们先假设Keap1-Nrf2/ARE通路活化是AS患者心功能降低的作用机制(简明机制示意图请见图1)，然后通过观察AS患者心功能Keap1-Nrf2/ARE的变化，并将心功能变化与Keap1-Nrf2/ARE通路指标进行相关性分析，旨在说明Keap1-Nrf2/ARE通路在AS患者心功能降低中的作用，探讨心功能降低的作用机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2012年5月-2013年6月安徽中医药大学第一附属医院风湿病科住院病人中，随机选取140例AS患者，其中男112例，女28例，男:女为4∶1，年龄18 ～60 岁，平均年龄(30.8 ±9.7)岁;病程0.5～28 年，平均病程(9.5 ±7.3)年。所有患者均符合依据1984年修订的强直性脊柱炎纽约诊断标准并参考2009年3月ASAS发布的中轴型SPA分类标准[21，22]，且排除原发性心血管疾病(如冠心病、先天性心脏病等)。另设60例正常对照(NC)组，男48 例，女12 例，男∶女为4∶1，年龄21～52 岁，平均年龄为(28.5±10.4)岁，均来自安徽中医药大

学第一附属医院体检中心，经体检和免疫学检查排除自身免疫性疾病，均为身体健康、无明显器质性疾病者。两组间年龄、性别无统计学差异。本研究方案已通过我院伦理审查委员会审批，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 观察指标及方法

1.2.1 心功能测定 应用美国GE VIVID 7超声诊断仪，探头频率为2～5 mHz。具体操作:患者取左侧卧位，对心脏进行常规检查，观察瓣膜结构、活动度、异常血流和频谱信号，测量二尖瓣口舒张早期峰值流速(E)、舒张晚期峰值流速(A)、舒张早期峰值流速/舒张晚期峰值流速(E/A)、左心房舒张期内径(LADd)、左心室舒张末期内径(LVDd)，采用改良simpson法测量左心室射血分数(EF)、每搏输出量(SV)、左心室短轴缩短率(FS)。所有指标均连续测量3次，取平均值，超声检查的操作及分析均由高年资的专业超声医师完成。

1.2.2 氧化应激指标测定 留取患者血清10 ml，3 000 r/min离心15 min，分离后进行4等份分装，-80℃冷冻保存统一检测。所有指标均参照试剂盒说明书进行操作。参照标准曲线计算标本相应指标的测定值。采用酶联免疫分析法(ELISA法)检测AS患者和正常对照组血清中通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化应激指标[丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、总抗氧化能力(TAOC)]、细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10)含量。Keap1、Nrf2 试剂盒购自美国 Millipore公司;MDA、ROS、RNS、SOD、CAT、TAOC试剂盒购自南京建成生物工程研究所;IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 试剂盒购自英国伯明翰公司。

图1 AS心功能降低假说Fig.1 Hypothesis of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis

1.2.3 实验室指标测定 所有被选对象均于清晨空腹时静脉采血10 ml，采集后标本立即送往安徽中医药大学第一附属医院实验中心检测，检测指标主要有:ESR、hs-CRP、IgG、IgA、IgM。检测方法:ESR用魏氏法，以 mm/h表示;hs-CRP、IgG、IgA、IgM 用日立7060型全自动生化分析仪进行测定，以mg/L表示。

1.2.4 主要症状量化评分标准 参照卫生部《新药(中药)临床研究指导原则》[23]，将具体的心功能症状换算成积分值。

1.2.5 AS临床评价指标评分[24]采用视觉模拟评分(Visual analog scales，VAS)、Bath强直脊柱炎疾病活动指数(Bath ankylosing spondylitis disease active index，BASDAI)、Bath强直脊柱炎功能指数(Bath ankylosing spondylitis functional index，BASFI)、Bath强直脊柱炎计量指数(Bath ankylosing spondylitis metrology index，BASMI)、Bath 强直性脊柱炎总体指数(Bath ankylosing spondylitis global index，BAS-G)对AS患者进行评分(0～10分)，分值越高，表示病情越重。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理，为连续性变量的实验数据用x-±s表示，样本均采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验;计量资料采用t检验;计数资料采用χ2检验;而采用Spearman软件进行相关性分析。当P＜0.05或P＜0.01时，才认为有统计学意义。

2 结果

2.1 AS组与NC组心功能变化检测结果 140例AS患者与60例NC组多普勒超声异常率比较得知，AS组多普勒超声心功能变化检测结果异常率为33.56%，NC组异常率为8.33%。见表1。

表1AS组与NC组心功能异常率比较(n，%)Tab.1 Comparison of echocardiographic abnormality between AS group and NC group(n，%)

2.2 AS患者和NC组心功能参数、氧化应激指标、细胞因子、炎症指标的比较 与NC组相比，AS活动期心功能参数(E峰、EF、E/A值)、抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)值均显著降低(P＜0.01或P＜0.05);心功能参数A峰、通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指标(ESR、CRP)值显著升高 (P＜0.01或P＜0.05)。与NC组相比，AS稳定期心功能参数(E峰、E/A值)、抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)值均显著降低(P＜0.01或P＜0.05);心功能参数A峰、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(TNF-α)、炎性指标(ESR、CRP)值显著升高(P＜0.01或 P＜0.05)。与AS稳定期相比，AS活动期心功能参数(E 峰、EF、E/A 值)、抗氧化指标(SOD、TAOC)、细胞因子(IL-10)值均显著降低(P＜0.01或 P＜0.05);通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指标(ESR、CRP)、AS 临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值显著升高(P＜0.01或 P＜0.05)。见表2。

表2 AS患者和NC组心功能参数、氧化应激指标等指标的比较( ± s)Tab.2 Comparison of indicators such as oxidative stress andcardiacfunction parametersbetween AS group and NC group(±s)

表2 AS患者和NC组心功能参数、氧化应激指标等指标的比较( ± s)Tab.2 Comparison of indicators such as oxidative stress andcardiacfunction parametersbetween AS group and NC group(±s)

Note:Vs NC group，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;vs NC group，3)P ＜0.01，4)P ＜0.05;vs AS in stable stage group，5)P ＜0.01，6)P ＜ 0.05.LADd:Left artrial diastolic diameter;LVDd:Left ventricular diastolic diameter;LVPWTd: Left ventricular posterior wall thickness at end-diastole;FS:Fraction shortening;EF:Ejection fraction;SV:Stroke volume;E peak:early diastolic E;A peak:late diastolic A.

Index NC group(60) AS in active stage(98) AS in stable stage(42) LADd(mm) 5.26 ±1.05 25.67 ±2.15 28.26 ±3.51 27.18 ±2.94 LVDd(mm) 46.17 ±1.34 44.69 ±1.84 45.23 ±1.46 LVPWTd(mm) 8.67 ±0.65 8.47 ±0.64 8.53 ±0.78 E peak(m/s) 1.25 ±0.32 0.92 ±0.121)5) 1.13 ±0.173) A peak(m/s) 0.83 ±0.18 1.09 ±0.281) 1.01 ±0.213) E peak/A peak 1.66 ±0.33 1.18 ±0.241)5) 1.31 ±0.363) SV(ml) 68.10 ±9.01 67.11 ±8.96 67.57 ±9.12 EF 66.01 ±5.87 63.34 ±3.221)5) 65.42 ±3.91 Keap1(ng/ml) 4.82 ±3.26 7.30 ±5.311)5) 4.98 ±3.34 Nrf2(ng/ml) 6.01 ±4.02 8.39 ±3.432)6) 6.78 ±4.69 ROS(ng/ml) 2.77 ±0.09 3.81 ±0.441)6) 3.26 ±0.254) RNS(U/ml) 97.82 ±6.83 133.12 ±24.231)5) 106.52 ±10.684) MDA(nmol/ml)10.65 ±6.11 34.36 ±19.711)5) 21.23 ±11.422) SOD(U/ml) 163.73 ±46.52 130.23 ±36.292)6) 142.68 ±39.864) CAT(ku/L) 301.48 ±130.46 226.57 ±122.931)251.33 ±126.524)6) TAOC(U/ml) 3.13 ±0.54 2.11 ±0.171)6) 2.69 ±0.464) IL-1β(pg/ml) 2.58 ±1.72 3.76 ±2.831)5) 2.87 ±2.25 TNF-α(ng/L) 19.76 ±17.8 280.25 ±167.681)5) 89.93 ±25.243) IL-4(ng/L) 425.61 ±246.18 355.65 ±262.132) 387.73 ±233.644) IL-10(ng/L)171.52 ±32.24 101.67 ±14.561)6) 138.45 ±27.464) ESR(mm/h) 9.21 ±3.53 32.27 ±12.511)5) 11.37 ±3.69 CRP(mg/L) 1.96 ±0.85 22.65 ±2.731)5) 5.48 ±0.74 VAS 0 8.34 ±2.585) 5.12 ±1.26 BASDAI 0 7.45 ±1.965) 5.31 ±1.68 BASFI 0 6.84 ±1.885) 4.97 ±1.62 BASMI 0 8.59 ±1.765) 5.48 ±1.59 BAS-G 0 8.12 ±1.165)

2.3 AS患者外周血Keap1、Nrf2异常者心功能变化 以60例正常对照组外周血Keap1、Nrf2数值统计正常值区间，Keap1(1.99 ～12.61 ng/ml)、Nrf2 (2.01 ～10.03 ng/ml)，筛选出 AS 患者 Keap1、Nrf2异常组别。与Keap1正常组比较，Keap1异常组心功能参数 LADd、A峰升高，E峰、E/A值降低;与Nrf2正常组比较，Nrf2异常组心功能参数A峰升高，E 峰、E/A 值、EF降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)。与Nrf2异常组比较，Keap1异常组心功能参数A峰升高，E峰、E/A值降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)。见表3。

2.4 AS患者外周血 Keap1和 Nrf2表达与氧化应激指标、细胞因子、心功能症状等指标的相关分析

Spearman相关分析结果显示，AS患者外周血通路蛋白Keap1表达与氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子 (IL-1β、TNF-α)、疾病活动性指标 (ESR、CRP)、AS 临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值、心悸症状呈正相关(P ＜0.05 或P ＜0.01);与抗氧化指标(SOD、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈负相关(P ＜0.05或 P ＜0.01)。AS患者外周血Nrf2表达与抗氧化指标(SOD、CAT)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈负相关(P＜0.05或 P＜0.01);与氧化指标(ROS、RNS、MDA)、AS 临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI)值、心悸症状呈正相关(P ＜0.05或P ＜0.01)。见表4。

表3 AS患者外周血Keap1、Nrf2异常者心功能参数变化(±s)Tab.3 Change of cardiac function parameters in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(±s)

表3 AS患者外周血Keap1、Nrf2异常者心功能参数变化(±s)Tab.3 Change of cardiac function parameters in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(±s)

Note:Vs NC group of the same group，1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;vs abnormal Nrf2 group，3)P ＜0.01，4)P ＜0.05.

Cardiac function parameters Keap1 Nrf2 Abnormal (n=56) Normal (n=84) Abnormal (n=51) Normal (n=89) LADd(mm) 28.78 ±3.812) 66.13 ±5.73 25.43 ±2.21 26.02 ±1.83 25.69 ±2.11 LVDd(mm) 45.5 ±12.07 45.96 ±1.5845.91 ±1.5846.15 ±1.38 LVPWTd(mm) 8.56 ±0.65 8.53 ±0.76 8.58 ±0.76 8.62 ±0.66 E peak(m/s)1.03 ± 0.311)3)1.21 ± 0.38 0.98 ±0.231)1.23 ± 0.35 A peak(m/s)0.98 ±0.172)3)0.86 ±0.13 1.07 ±0.261)0.83 ±0.18 E peak/A peak 1.41 ±0.411)4)1.63 ±0.37 1.39 ±0.361)1.65 ±0.32 SV(ml) 68.15 ±9.78 68.23 ±8.9568.13 ±8.9168.19 ±8.87 EF(%) 65.85 ±5.89 66.01 ±5.87 64.08 ±5.152)

表4 AS患者外周血Keap1和Nrf2表达与氧化应激指标、细胞因子、心功能症状等指标的相关分析(r，n=140)Tab.4 Correlation analysis of the Keap1 and Nrf2 expression with related indicatorssuch asoxidative stress，cytokines，symptoms of cardiac function in AS patients(r，n=140)

表5 AS患者心功能参数与氧化应激、心功能症状等指标的相关分析(r，n=140)Tab.5 Correlation analysis of cardiac function parameters with related indicators such as oxidative stress，cytokines，symptoms of cardiac function in AS patients(r，n=140)

2.5 AS患者心功能参数与氧化应激指标、症状体征积分等指标的相关分析 Spearman相关性分析显示，心功能参数E峰与抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈正相关，与通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS 临床评价指标(VAS、BAS-DAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、炎 性 指 标 (ESR、CRP)、免疫球蛋白G(IgG)、病程呈负相关;心功能参数A峰与通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)、AS 临床评价指标、心悸症状呈正相关，与抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈负相关;心功能参数 E/A比值与抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈正相关，与通路蛋白 Keap1、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(TNF-α)、AS临床评价指标、病程呈负相关;心功能参数EF与心悸症状、病程呈负相关;心功能参数FS与通路蛋白Keap1呈负相关(P＜0.05)。见表5。

3 讨论

强直性脊柱炎是以骶髂关节和脊柱中轴关节慢性炎症为主的自身免疫性疾病，临床上若延误诊治，易引起关节以外的结缔组织的病变[25]。心血管系统因富含丰富的结缔组织与血管，因此很容易受累。自由基是机体内很强的氧化反应能力的分子、离子、原子或原子团，当自由基过度产生或机体的抗氧化防御体系功能受损时，机体将处于氧化应激状态，从而导致组织细胞损伤[26，27]。

本研究结果显示，33.56%的AS患者存在心功能降低，与NC组相比，AS患者心功能参数(E峰、E/A、EF)值均显著降低(P＜0.01);A峰显著升高(P＜0.01)。与NC组相比，AS患者血清中SOD、CAT、TAOC值均显著降低(P ＜0.01或 P ＜0.05)，ROS、RNS、MDA 值显著升高(P ＜0.01或 P ＜0.05)。ROS、RNS、MDA 是反映机体氧化水平的关键指标;而SOD、CAT、TAOC是反映机体抗氧化水平的关键指标;本研究发现心功能降低的AS患者存在氧化应激紊乱，处于氧化水平升高和抗氧化能力明显下降的状态。与NC组相比，AS患者细胞因子(IL-1β、TNF-α)和炎性指标(ESR、CRP)值显著升高(P ＜0.01)，细胞因子(IL-4、IL-10)值显著降低(P＜0.01或 P ＜0.05)。与 AS稳定期相比，AS活动期临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)值显著升高(P ＜0.01或 P ＜0.05)。IL-1β、TNF-α 属于致炎细胞因子[28]，而 IL-4、IL-10 属于抗炎细胞因子，ESR、CRP、VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G可反映疾病的活动程度和严重程度;本研究发现心功能降低的AS患者处于疾病活动状态且存在细胞因子失衡，炎性细胞因子含量明显升高，与NC组相比，心功能降低的AS患者 Keap1、Nrf2表达上升;这表明心功能降低的AS患者存在Keap1-Nrf2/ARE通路的活化。

图2 AS心功能降低机制Fig.2 Mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis

为进一步验证Keap1-Nrf2/ARE通路在AS患者心功能降低中的影响，本研究发现，与AS患者外周血Keap1、Nrf2正常组比较，Keap1、Nrf2异常组心功能参数E峰、E/A、EF值均显著降低;A峰显著升高，提示AS患者外周血Keap1、Nrf2升高会直接或间接导致心功能降低。

本研究通过相关分析得知，心功能降低的AS患者心功能参数E峰与抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、抑炎细胞因子(IL-4、IL-10)呈正相关，而与通路蛋白 Keap1、Nrf2、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α)、炎性指标(ESR、CRP)、免疫球蛋白G(IgG)、病程呈负相关;心功能参数A峰与通路蛋白Keap1、Nrf2、氧化指标(ROS、RNS、MDA)、促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α)、心悸呈正相关，与抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)、抑炎细胞因子(IL-4、IL-10)呈负相关。而AS患者外周血通路蛋白 Keap1表达与氧化指标(ROS、RNS、MDA)、细胞因子(IL-1β、TNF-α)、疾病活动性指标(ESR、CRP)、AS 临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI、BASMI、BAS-G)、心悸症状呈正相关;与抗氧化指标(SOD、TAOC)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈负相关。AS患者外周血 Nrf2表达与抗氧化指标(SOD、CAT)、细胞因子(IL-4、IL-10)呈负相关;与氧化指标(ROS、RNS、MDA)、AS 临床评价指标(VAS、BASDAI、BASFI)、心悸症状呈正相关。这提示Keap1、Nrf2的水平与AS疾病活动状态、氧化应激状态、细胞因子平衡、心功能参数明显相关。当体内(ROS、RNS)等氧化指标含量升高时，Keap1、Nrf2表达上升，Keap1-Nrf2-ARE信号通路活化，抗氧化指标(SOD、CAT、TAOC)含量下降，机体抗氧化能力降低，促使细胞因子失衡(IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子含量升高，而IL-4、IL-10等抑炎细胞因子含量降低)ESR、CRP等疾病活动性指标升高，导致免疫复合物异常沉积增多，促使AS发病，当免疫复合物异常沉积于心组织时，致使心组织或器官受到损伤或破坏，UCG检测则提示反映心室舒张功能的指标E峰和E/A比值下降，A峰升高;反映心室收缩功能的指标射血分数EF降低，临床上则出现心悸等心功能降低症状。

本研究结果与本研究前假说基本一致(见图2)，鉴于以上研究结果，我们可以认为氧化应激可能参与了AS心功能降低的发生与发展，Keap1-Nrf2-ARE信号通路的活化可能是心功能降低的机制。

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[收稿2013-09-25 修回2013-11-20]

(编辑 许四平)

Exploring mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis based on Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway

QI Ya-Jun，LIU Jian，ZHENG Li，WAN Lei，CAO Yun-Xiang，SUN Yue，WANG Fang.Graduate Department of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China

Objective:To explore the mechanism of cardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis based on Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway.MethodsExperiment group included 140 ankylosing spondylitis(AS)patients and control group included 60 healthy individuals.Echocardiography(UCG)was used to detect cardiac function parameters.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was adopted to determine serum proteins，oxidative stress indicators and cytokines.Erythrocyte sedimentation and plasma C reactive protein，immunoglobulin were detected with Westergren method and Hitachi 7060 automatic biochemical analyzer respectively.Results(1)Compared with the normal control group，character of AS group in active stage:cardiac function parameters(E peak，EF，E/A)，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)decreased(P ＜ 0.01 or P ＜ 0.05 all).A peak，Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)increased(P ＜ 0.01 or P ＜0.05 all).(2)Compared with the normal control group，character of AS group in stable stage:cardiac function parameters(E peak，E/A)，Keap1，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)decreased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).A peak，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)increased(P ＜ 0.01 or P ＜0.05 all).(3)Compared with AS group in stable stage，character of AS group in active stage:cardiac function parameters(E peak，EF，E/ A)，antioxidant indicators(SOD，TAOC)，cytokines(IL-10)decreased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)，clinical evaluation indicators(VAS，BASDAI，BASFI，BASMI，BAS-G)increased(P ＜0.01 or P ＜0.05 all).(4)Compared with AS patients with normal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood，A peak increased while E peak and E/A decreased in AS patients with abnormal Keap1 or Nrf2 of peripheral blood(P ＜0.01 or P ＜0.05).(5)Spearman correlation analysis showed:AS parameters of cardiac function in patients with E peak and antioxidant indicators (SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)showed significant positive correlation.E peak and Keap1，Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，inflammatory indicators(ESR，CRP)，clinical evaluation indicators(VAS，BASDAI，BASFI，BASMI，BAS-G)，IgG，course of the disease were significantly negatively correlated.A peak and Nrf2，oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(IL-1β，TNF-α)，clinical evaluation indicators，Palpitation showed significant positive correlation.A peak and antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)were significantly negatively correlated.E/A and Keap1，antioxidant indicators(SOD，CAT，TAOC)，cytokines(IL-4，IL-10)showed significant positive correlation.E/A and oxidation index(ROS，RNS，MDA)，cytokines(TNF-α)，cxcinical evaluation indicators，course of the disease were significantly negatively correlated.EF and course of the disease were significantly negatively correlated.FS and Keap1 showed significant negative correlation.ConclusionCardiac function decreasing in patients with ankylosing spondylitis is 33.56%.The characteristic performance is that E peak，E/A decreased while A peak increased.E peak，E/A and antioxidant indicators，anti-inflammatory cytokines show significant positive correlation.E peak，E/ A and Keap1，oxidation index，pro-inflammatory cytokines，inflammatory indicators are significantly negatively correlated.A peak and Keap1，oxidation index，pro-inflammatory cytokines show significant positive correlation.A peak and antioxidant indicators，anti-inflammatory cytokines are significantly negatively correlated.The rising of Keap1 expression cause activate the Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway.After the signaling pathway is activated，the body′s antioxidant ability decreased，pro-inflammatory cytokines imbalanced，inflammation index increased.When the body is long be in unbalance condition，the number of abnormal immune complex deposition increased.In the end，the result is that AS is caused and cardiac function is decreased.

Ankylosing Spondylitis;Cardiac function;Keap1;Nrf2;Oxidative stress

R593.23

A

1000-484X(2014)05-0654-08

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.019

①本文受国家自然科学基金(No.81173211)、国家中医药重点学科中医痹病学建设项目(国中医药发[2009]30号)、安徽省科技厅科研计划项目(09020304046)、安徽省卫生厅中医药科研项目(2009ZY05)、安徽现代中医内科应用基础与开发研究省级实验室建设项目(科条[2008]150号)、安徽中医学院科技创新团队项目(2010TD005)资助。

②安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科，合肥230031。

③Department of Radiation Biology，City of Hope National Medical Center and Beckman Research Institute，Duarte，CA91010，USA。

齐亚军(1987年-)，男，主要从事中医药防治风湿病的研究。

及指导教师:刘 健(1964年-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事中医药防治风湿病的研究，E-mail:liujianahzy@126.com。