CYFRA21-1双抗体夹心酶联免疫检测方法的研制①

张慧茹 翟晋豫 王雪琴 刘 珍 王云龙 米 海 (河南工业大学生物工程学院，郑州450001)

CYFRA21-1双抗体夹心酶联免疫检测方法的研制①

张慧茹 翟晋豫②王雪琴 刘 珍 王云龙②米 海 (河南工业大学生物工程学院，郑州450001)

目的:建立人血清CYFRA21-1双抗体夹心酶联免疫检测方法。方法:以高碘酸钠法标记4株自制的CYFRA21-1单克隆抗体，从中筛选配对抗体，建立双抗体夹心ELISA检测方法，并对其特异性、稳定性和灵敏度进行评价。结果:在4株单克隆抗体中筛选出1对配对抗体:2F9株做包被抗体、6F11株做酶标抗体。以0.50 μg/ml的包被浓度、1∶6 000的酶标抗体稀释度建立双抗体夹心检测方法。标准曲线在0.7～25 ng/ml范围内成线性关系，相关性为99.08%，最低检测限为0.666 8 ng/ml，回收率为98.14%;与血清类似物的交叉性反应低于0.1%;批内(n=10)、批间(n=5)精密度分别为6.8%和11.4%，与国外试剂盒检测对比的相关性为91.42%。结论:成功地建立了双抗体夹心ELISA检测人血清CYFRA21-1的方法，为后续的检测试剂盒的生产奠定基础。

CYFRA21-1;双抗体夹心ELISA;肺癌;检测试剂盒

目前，上皮癌的发病率越来越高，致死率也不断提高，这引起了人们越来越多的关注，肺癌、食管鳞癌、宫颈癌、鼻咽癌等已成为各大医疗机构及科研院所研究的重点。出于对此类癌症的早期检测和预防，许多肿瘤标志物被发现并应用，主要包括有细胞角蛋白19片段(Cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase，NSE)、癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen， CEA)等[1-3]。神经元特异性烯醇化酶是一类属于与神经性内分泌组织起源相关的肿瘤标志物，对于上皮癌的诊断意义不大。癌胚抗原是一类具有广谱性的辅助癌症诊断标志物[4]。基于此，对于上皮癌的诊断以细胞角蛋白19片段的应用较为广泛。

国内外已有大量研究报道指出，CYFRA21-1可作为口腔鳞状细胞癌、宫颈鳞癌、肺癌、胰腺癌等上皮细胞肿瘤性疾病的标志物[3，5]，通过检测 CYFRA21-1在人血清中含量的变化，从而分析癌症患者上皮细胞癌的生长状况和患者的愈后。因此，各类CYFRA21-1诊断检测手段便应运而生。目前常用的试剂盒多为德国Roche、法国CIS等国外产品，与国外产品相比，国内研发的检测试剂盒存在灵敏度低的问题，因此，本实验目的在于研发CYFRA21-1双抗体夹心ELISA检测法，以提高国产检测试剂盒的灵敏性。

1 材料与方法

1.1 材料 4株CYFRA21-1的mAb由河南工业大学与河南省生物工程中心联合制备(腹水抗体为IgG1型抗体、效价高于 106)。辣根过氧化物酶(HRP)购于Sigma公司。HRP-羊抗鼠IgG购于美国Jackson公司。CYFRA21-1标准蛋白购于美国Cal Bioreagents公司。CK8、CK18购于Sigma公司。绒毛促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)购于上海科兴生物有限公司。53名病患血清取自河南肿瘤医院。CYFRA21-1 ELISA检测试剂盒为德国Roche公司产品。

1.2 方法

1.2.1 HRP-mcAb的制备 利用改良过碘酸钠法[6]将辣根过氧化物酶与4株抗 CYFRA21-1的mcAb进行偶联，得到的酶-抗体(HRP-IgG)于－20℃保存。

1.2.2 配对抗体的筛选 取一定值阳性血清筛选最佳配对酶标抗体。以实验室经验浓度100 ng/孔包被4种酶标抗体4℃过夜，PBST洗涤1遍，加入封闭液 150 μl/孔，37℃封闭 2 h，PBST 洗涤5 遍，加入定值血清，温育30 min后洗涤;再加入1∶3 000倍稀释的4种酶标抗体，37℃温育30 min，洗涤;加底物显色20 min后，终止液终止，双波长读取光密度值，分析最佳配对结果。

1.2.3 双抗体夹心ELISA方法的建立 以棋盘滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。将包被抗体稀释为 3.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/ml，加到96孔板中，0.1 ml/孔，4℃过夜，洗涤1 次，拍干。加入封闭液37℃封闭2 h，洗涤、拍干，加入定值阳性血清，37℃反应30 min后洗涤、拍干;加入不同稀释倍数的酶标抗体，0.1 ml/孔，37℃温育 30 min，洗涤;底物显色20 min后，终止液终止，酶标仪450 nm (参考波长630 nm)处检测光密度值(OD)，确定最佳双抗体夹心ELISA检测方法。

1.2.4 标准曲线的绘制 采用建立的双抗体夹心ELISA 方法，将 CYFRA21-1分别稀释到100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0 ng/ml，每个浓度做 3个重复，测定OD450/630值，并以抗原浓度的自然对数值为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。

在标准曲线范围内选取高、中、低3个抗原浓度(n=5)，测定其OD值，依标准曲线查找对应的抗原浓度，与实际抗原浓度计算回收率。

1.2.5 特异性检测 以建立的双抗体夹心ELISA检测方法，分别检测CK8、CK18、人绒毛促性腺激素(HCG)、人促卵泡激素(FSH)是否与CYFRA21-1之间存在交叉反应，检验检测方法的特异性。

1.2.6 精密性测定 在标准曲线范围内选取高、中、低3个抗原浓度，在同一块板上测定10次，另在不同包被板上检测5次，每板测定5孔，对比其OD值变化，分别计算批内精密性和批间精密性(变异系数CV)。

1.2.7 试剂盒对比检测 利用医院获取的53份阳性血清样本，通过本实验构建的ELISA检测方法与购买的检测试剂盒同时进行检测。并依照检测结果比较二者的相关性。

2 结果

2.1 配对抗体的筛选 在实验室常规ELISA检测的基础上，通过正交试验筛选配对的酶标抗体，结果见表1。

依据表1的结果可以看出:以2F9株酶标单抗做包被抗体、6F11株酶标单抗做酶标抗体获得最佳的ELISA检测结果，说明2株单抗识别的抗原决定簇位点距离较远。

2.2 双抗体夹心ELISA检测方法的建立 以2F9株酶标单抗做包被抗体、6F11株酶标单抗做酶标抗体，通过棋盘法建立双抗体夹心ELISA检测方法。

从表2中的数据可以看出当包被抗体浓度为0.50 μg/ml(50 ng/孔)、酶标单抗稀释浓度为1∶6 000时ELISA检测效果较好，此时空白值为0.032，血清值为 2.044。

表1 筛选配对酶标抗体的结果Tab.1 Results of antibody pairing test

表2 单抗包被浓度及酶标单抗稀释浓度的确定Tab.2 Determination coating concentration of mAb and dilution of mAb-HRP

图1 CYFRA21-1标准曲线Fig.1 Standard curve of CYFRA21-1

2.3 绘制标准曲线 将CYFRA21-1稀释不同浓度，采用双抗体夹心ELISA法测定OD456/630值，绘制标准曲线。

由图1可知，抗原在0.7～25 ng/ml范围内成线性关系，取该范围的抗原浓度与OD值确定二者的回归方程:y=1.569x+0.303 1，r2=0.990 8。

10个空白孔OD±3SD(标准差)计算抗原浓度0.666 8 ng/ml，即最低检测限为 0.666 8 ng/ml。

在线性范围内取高(20 ng/ml)、中(10 ng/ml)、低(1 ng/ml)3个抗原浓度，测定其OD值，计算其平均回收率为98.14%，如表3。

2.4 特异性检测 以角蛋白CK8、CK18、绒毛促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)为抗原进行双抗体夹心 ELISA法检测，对比检测结果证实:CYFRA21-1与其他各类物质之间无交叉反应，证明其特异性较好。

表3 不同抗原浓度下对应的回收率Tab.3 Recovery of different concentration of CYFRA21-1

2.5 精密性测定 通过高(20 ng/ml)、中(10 ng/ ml)、低(1 ng/ml)3个抗原浓度，在同一块板上测定(批内)、在不同包被板上检测(批间)OD值变化，计算出批内精密性(变异系数CV＜6.8%)和批间精密性(变异系数CV＜11.4%)，如表4。说明建立的检测方法具有较好的重复性。

2.6 试剂盒对比验证试验 应用建立的双抗体夹心ELISA检测方法检测收集的53份阳性血清，其检测结果与购买的CYFRA21-1检测试剂盒的检测结果进行比较，结果如图2所示。

结果显示，本实验条件下制备并经配对实验选择的两对单克隆抗体与试剂盒对比相关性良好，r=0.956 1，P ＜ 0.001，回归方程:y=0.959 4x+ 0.080 9，r2=0.914 2。

表4 精密性测定结果Tab.4 Results of precision detection

20 2.311 ±0.007 6.5 2.289 ±0.008 9.1

图2 试剂盒和构建的双抗体夹心法检测浓度结果对比Fig.2 Results of double antibody sandwich ELISA compare with kits

3 讨论

肺癌是常见的恶性肿瘤，死亡率居各类恶性肿瘤之首位，且发病率逐年上升，由于CYFRA21-1在非小细胞肺癌中表达量较高[7]，因此，对于与肺良性疾病鉴别较为困难、且不能手术的非小细胞肺癌来说，研发CYFRA21-1的诊断试剂盒，对该病进行早期诊断、早期治疗是提高肺癌患者生存的主要手段。

目前，国内CYFRA21-1的检测方法主要有酶联免疫法、电化学发光法、免疫荧光法、液体芯片技术等。王雅杰等[8]采用液体芯片技术检测血清中CYFRA21-1水平，与ELISA、电化学发光技术的一致率达到 90.2%、77.2%;杨恩环等[9]采用流式荧光法检测多种肿瘤标志物，与 ELISA试剂盒相比，流式荧光法的检测线性范围更宽，而灵敏度与电化学发光法一致;王彪等[10]自制的CYFRA21-1时间分辨荧光免疫分析试剂盒进行临床检测评价，与Roche电化学发光试剂盒阳性符合率为97.40%。可以看出，新的技术和方法为CYFRA21-1的检测提供高通量、快捷、便利的方法，但酶联免疫的ELISA检测以其较高的灵敏度、较宽的线性检测范围和操作简捷，成为各种检测方法中的经典方法。

在实验中我们发现，以2F9株单克隆抗体为包被抗体、6F11株单克隆抗体为酶标抗体，采用棋盘法建立双抗体夹心ELISA检测方法时，当包被抗体浓度高于50 ng/ml时，OD值降低，说明包被抗体的浓度对血清CYFRA21-1含量的检测有一定的影响，可能存在过量的抗原抗体结合物影响标记抗体的结合，从而影响显色和抗原浓度的测定，因此，我们将CYFRA21-1抗原进行不同梯度的稀释，测定其与OD值之间的相关性，得出以下结论:CYFRA21-1抗原在0.7～25 ng/ml范围内，与测定的OD值呈线性关系，当低于或超过这个范围，OD值均有所偏差，不能代表抗原浓度的实际值。

本实验在自制单克隆抗体的基础上(结果另见报道)，利用单克隆抗体的高度敏感性，建立双抗体夹心酶联免疫检测方法，能够在0.7～25 ng/ml范围内较好地检测正常人血清中CYFRA21-1的含量，且最低检测限达到0.666 8 ng/ml，其特异性与精密性均较好，对于后期应用于临床检测正常与病理人群的血清水平奠定基础。该方法也为上皮癌的诊断、病程发展、疗效观察、用药指导及愈后提供了辅助性的指导。

[1]Boeck S，Wittwer C，Heinemann V，et al.Cytokeratin 19-fragments(CYFRA 21-1)as a novel serum biomarker for response and survival in patients with advanced pancreatic cancer[J].Br J Caner，2013，108(8):1684-1694.

[2]Pang L，Wang J，Jiang Y，et al.Decreased levels of serum cytokeratin 19 fragment CYFRA 21-1 predict objective response to chemotherapy in patients with non-small cell lung cancer[J].Exp Ther Med，2013，6(2):355-360.

[3]Park SY，Lee JG，Kim J，et al.Preoperative serum CYFRA 21-1 level as a prognostic factor in surgically treatedadenocarcinoma of lung[J].Lung Cancer，2013，79(2):156-160.

[4]Okamura K，Takayama K，Izumi M，et al.Diagnostic value of CEA and CYFRA 21-1 tumor markers in primary lung cancer[J].Lung Cancer，2013，80(1):45-49.

[5]Liu L，Liu B，Zhu LL.CYFRA21-1 as a serum tumor marker for follow-up patients with squamous cell lung carcinoma and oropharynx squamous cell carcinoma[J].Biomark Med，2013，7(4): 591-599.

[6] 颜子颖，王海林等译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社，1998:413-415.

[7]Jiro Fujita，Kazutaka Dohmoto，Satoko Hojo，et al.The point mutation in the promoter region and the single nucleotide polymorphism in exon 1 of the cytokeratin 19 gene in human lung cancer cell lines[J].Lung Cancer，2001，34:387-394.

[8]王雅杰，张 锟，方 芳，等.应用液体芯片技术联合检测癌胚抗原、19片段角蛋白和神经元特异性烯醇化酶对于肺癌诊断价值的研究[J].中国实验诊断学，2006，10(6):588-592.

[9]杨恩环，周宇琼.流式荧光法检测多肿瘤标志物性能评估及临床应用[J].临床检验杂志，2012，30(12):960-963.

[10]王 彪，崔晓丙，张国兰，等.细胞角蛋白19片断时间分辨荧光免疫分析试剂盒的评价及临床应用研究[J].热带医学杂志，2008，8(1):6-11.

[收稿2013-12-01 修回2014-01-03]

(编辑 张晓舟)

Preparation and preliminary application of double antibody sandwich ELISA for CYFRA21-1

ZHANG Hui-Ru，ZHAI Jin-Yu，WANG Xue-Qin，LIU Zhen，WANG Yun-Long，MI Hai.Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China

Objective:To establish the detection method of double-antibody sandwich ELISA about CYFRA21-1 in human serum.MethodsThe paired antibody were screened among four strains mAbs of CYFRA21-1，which was marked by sodium periodate method.The detecting method of double antibody sandwich ELISA was optimizted，and evaluated by specificity，stability and sensitivity.ResultsThe results showed that a paired of antibody，which was 2F9 as the coated antibody and 6F11 as the labeled antibody，was selected from four mAbs.It was the optimum condition of double antibody sandwich ELISA that the coating antigen concentration of 2F9 was 0.50 μg/ml，while the labeled antibody of 6F11 was diluted 6 000 times.The linear range of standard curve was 0.7-25 ng/ ml with r2=0.990 8，while the limit of detection was 0.666 8 ng/ml，the recovery rate was 98.14%.The cross-reactions with the other analogues in serum were less than 0.1%.The coefficient of variation in group(n=10)was 6.8%，whereas coefficient of variation among group(n=5)was 11.4%.The correlation compared with other foreign ELISA kit was 91.42%.ConclusionIn brief，we successfully established the method of double antibody sandwich ELISA detecting CYFRA21-1 level in human serum，laying the foundation for the production of CYFRA21-1 ELISA kit.

CYFRA21-1;Double antibody sandwich ELISA;Lung cancer;Detection kit

R446.6

A

1000-484X(2014)05-0644-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.016

①本文受河南省重点攻关项目(132102310169、102102310093、102102310082)资助。

②河南师范大学生命科学学院，新乡453007。

张慧茹(1967年－)，女，博士，硕士生导师，主要从事疾病诊断检测技术方面的研究，E-mail:zhr67@163.com。