7型腺病毒受体同源性多肽的筛选和研究①

许元生 田新贵 刘铭龙 李晨阳 周 荣

(广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室，广州510120)

7型腺病毒受体同源性多肽的筛选和研究①

许元生 田新贵 刘铭龙 李晨阳 周 荣

(广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室，广州510120)

目的:筛选7型腺病毒的结合多肽，并研究其与腺病毒受体的相关性。方法:利用噬菌体肽库，筛选7型腺病毒的结合多肽，并制备其抗体，利用抗体进行免疫荧光实验，观察抗体与细胞膜的结合情况。结果:筛选到了GTS09多肽，其与噬菌体的复合物能特异的结合7型腺病毒，亲和常数可以达到1.93×1010L/mol;制备了GTS09的兔多克隆抗体，免疫荧光显示，该抗体可以特异地结合在293细胞的细胞膜上。结论:抗GTS09的抗体可以特异的结合于细胞膜上，表明7型腺病毒受体可能与GTS09具有一定的同源性，为鉴定和分离7型腺病毒受体打下了基础。

7型腺病毒;受体;多肽;免疫荧光

腺病毒受体可以高效的黏附腺病毒，并介导腺病毒基因组进入细胞核，而且与多种肿瘤的发生和转移有密切关系[1-5]。随着人们对使用腺病毒载体所进行的基因治疗研究的增多，腺病毒受体的研究近十几年来得到迅速发展，多个腺病毒受体相继被发现和鉴定。但7型腺病毒的受体至今尚未被发现和分离[6]。

本研究利用噬菌体肽库筛选了一个能特异结合7型腺病毒的多肽，并利用该多肽的多克隆抗体研究该多肽和7型腺病毒受体的一些关联，对发现7型腺病毒受体做了一些探索性的尝试工作。

1 材料与方法

1.1 实验材料 噬菌体展示12肽文库试剂盒(Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit)购自美国New England Biolabs，噬菌体宿主菌为ER2738; HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate购自美国 GE公司;7型腺病毒(Ad7)由本实验室保存和培养。

1.2 实验方法

1.2.1 7型腺病毒对噬菌体12肽库进行淘选 淘选方法参照NEB公司Ph.D.-12试剂盒使用手册:将Ad7腺病毒包被于ELISA板，4℃过夜;BSA封闭1 h。加入4×1010的噬菌体，室温温和摇动60 min。TBST缓冲液洗板10次;pH2.2的 Glycine-HCl洗脱。洗脱物加入ER2738培养物中，37℃剧烈摇动培养4.5 h;培养物4℃ 10 000 r/min离心10 min，加入1/6体积的 PEG/NaCl，4℃沉淀过夜。4℃、10 000 r/min离心，沉淀重悬于200 μl TBS中，即为扩增后的洗脱物。取少量用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。取100 μl进行第二轮淘选，如此进行四轮淘选。经4轮淘选的平板上随机挑取单个噬菌斑，扩增后做ELISA进行阳性克隆鉴定。将Ad7以1 μg/孔的量加入ELISA板，于4℃包被过夜。BSA封闭，然后分别加入制备好的噬菌体上清，于37℃保温1 h，用PBST(PBS+0.3%Tween20)洗3次后，加入 HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(1∶5000稀释)，于37℃保温1 h，再用PBST洗3次。TMB显色，测定OD450 nm值。ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆，送测序公司测序。

1.2.2 抗多肽抗体的制备 将筛选到的多肽用BSA偶联后，委托艾比玛特生物医药(上海)有限公司(Abmart)制备兔多克隆抗体，并用相应的多肽偶联树脂对制备的兔血清进行纯化。

1.2.3 非竞争ELISA法测亲和常数 采用非竞争ELISA方法测定与7型腺病毒的亲和常数[7]:分别用2 ×109、1 ×109、0.5 ×109、0.25 ×109的 Ad7 包被ELISA板，调整噬菌体浓度，并按1∶2～1∶256倍比稀释，加至不同包被量的反应孔中，加HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(1∶5 000 稀释)，TMB 显色，测OD450，根据抗原抗体结合的s曲线带入公式Ka=(n-1)/(nAb′-Ab)计算亲和常数，式中Ab和Ab′，分别表示当抗原浓度为Ag和Ag′时，产生半数吸光值的抗体浓度(mol/L)，n=Ag/Ag′，当 n=2时，可得3个值，n=4时，可得2个值，n=8时，可得1个Ka值，求出6个Ka的均值作为最终结果。

1.2.4 免疫荧光 将生长良好的293细胞接种于盖玻片上，培养过夜，洗涤后，5%脱脂牛奶封闭1 h，加适量兔抗多肽抗体孵育1 h，洗涤后加FITC标记的羊抗兔二抗，孵育1 h，PBS洗涤后，荧光显微镜观察并拍照。

2 结果

2.1 噬菌体肽库淘选结果 经四轮淘选后，ELISA鉴定的23个阳性克隆(结果见图1)送测序公司测序，结果有4 个(9#、118#、136#、138#)对应的12 肽序列为GTSAFHKPTSFP(命名为GTS09)，且这4个克隆的ELISA值都很高(比阴性对照高出20倍以上)。

2.2 亲和常数测定 采用非竞争ELISA法测定GTS09-phage与Ad7的亲和常数，结果如图2所示。经计算，亲和常数为(1.93 ±0.72)×1010L/mol。

2.3 免疫荧光结果 将GTS09偶联BSA后制备其兔多抗血清，再经GTS09偶联的树脂纯化后，得到抗GTS09的多抗。将此抗体与293细胞进行免疫荧光试验，结果如图3所示，对照(无关兔抗体)与细胞几乎没有结合(图3A)，而anti-GTS09特异的结合在293的细胞膜上(图3B)。

图1 23个阳性克隆的ELISA结果Fig.1 ELISA of 23 positive clones

图2 GTS09-phage与不同量的Ad7结合反应的ELISA曲线Fig.2 ELISA curves of GTS09-phage to different amount of coated Ad7

图3 anti-GTS09的免疫荧光结果(×200)Fig.3 Immunofluorescence of anti-GTS09 antibody on 293 cell(×200)

3 讨论

腺病毒利用不同的受体黏附于细胞表面分子，然后穿入、内化，导致细胞感染。在过去的几年里，受体分子的研究进展迅速，但是腺病毒许多血清型的特异性受体还没有确定，也可能还有其他受体尚未发现。

我们利用7型腺病毒对噬菌体肽库进行筛选，得到了能特异结合7型腺病毒的结合多肽GTS09，其与噬菌体的复合物与7型腺病毒的亲和常数可以达到1.93×1010L/mol，高于一般的抗原抗体的亲和常数，我们制备了其多克隆抗体，与293细胞进行免疫荧光实验，发现该抗体可以特异的结合于293细胞的细胞膜上，我们推测7型腺病毒的受体可能与GTS09有一定的同源性。展望未来，通过2D电泳、质谱分析等技术，我们就有可能得到7型腺病毒的受体及其序列等信息，为该受体的发现和分离奠定基础。

[1]Kawabata K，Tashiro K，Sakurai F，et al.Positive and negative regulation of adenovirus infection by CAR-like soluble protein，CLSP[J].Gene Ther，2007，14:1199-1207.

[2]Meier O，Greber UF.Adenovirus endocytosis[J].J Gene Med，2004，6:S152-S163.

[3]Zhang LL，He DL，Li X，et al.Overexpression of coxsackie and adenovirus receptor inhibit growth of human bladder cancer cell in vitro and in vivo[J].Acta Pharmacol Sin，2007，28(6): 895-900.

[4]Qin M，Escuadro B，Dohadwala M，et al.A novel role for the coxsackie adenovirus receptor in mediating tumor formation by lung cancer cells[J].Cancer Res，2004，64(18):6377-6380.

[5]Fok PT，Huang KC，Holland PC，et al.The Coxsackie and adenovirus receptor binds microtubules and plays a role in cell migration[J].J Biol Chem，2007，282(10):7512-7521.

[6]Zhang Y，Bergelson JM.Adenovirus receptors[J].J Virol，2005，79(19):12125-12131.

[7]Beatty JD，Beatty BG，Vlahos WG.Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay[J].J Immunol Methods，1987，100(1-2):173-179.

[收稿2013-12-01 修回2014-02-27]

(编辑 倪 鹏)

Screening and research of homologous peptide with adenovirus receptor

XU Yuan-Sheng，TIAN Xin-Gui，LIU Ming-Long，LI Chen-Yang，ZHOU Rong.State Key Lab of Respiratory Disease，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China

Objective:To screen the binding peptide against adenovirus type 7(Ad7)and evaluate the relevance with the adenovirus receptor.MethodsBinding peptide against Ad7 was screened by panning the phage display 12 peptides library.The antibody against the selected peptide was prepared and was used to study the binding to the membrane by immunofluorescence technique.ResultsUsing Ad7 as the target protein，GTS09 peptide was selected from the phage display 12 peptides library by biopanning.GTS09-phage complex could significantly bind Ad7，with the affinity constant up to 1.93 × 1010L/mol;at the same time，immunofluorescence showed that antibody of GTS09 could specifically bind to membrane of 293 cell.ConclusionAntibody against GTS09 peptide could specifically bind to membrane of 293 cell，which shows that the peptide may presumably have homology with the cell receptors of Ad7.

Adenovirus type 7;Receptor;Peptide;Immunofluorescence

R392.11

A

1000-484X(2014)05-0651-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.018

①本文为中国博士后基金(2012M511780)。

许元生(1975年-)，男，博士，主要从事人源抗体和多肽药物的研发工作。

及指导教师:周 荣(1965年-)，男，研究员，主要从事病毒学方面研究。