不同生长基质对骨骼肌成肌干细胞分化融合的影响及初步分析

李晓雨 高颖娜 汤维芳 李 孟 郑宏良

在机体中肌肉受到损伤或其他方式损害时，处于静态状态的成年骨骼肌干细胞被激活后增殖、迁移到指定的位点相互融合或受损的肌纤维形成新的肌纤维［1］。在体内和体外，细胞外基质在决策细胞命运和行为中发挥了重要的作用［2］。细胞外基质主要功能是支持各种细胞的生长和维持。同时细胞外基质在骨骼肌肌纤维的力传递，维持和修复中起着重要的作用。在损伤和患病状态，细胞外基质显著性的改变从而改变肌肉功能的属性［3］。本研究组在体外分化培养小鼠骨骼肌成肌干细胞C2C12的基础上，探讨了3种常用细胞外生长基质基质胶、Ⅰ型胶原、多聚赖氨酸对C2C12细胞分化形成肌管融合率的影响。

材料与方法

1．材料:细胞:C2C12细胞株(ATCC)试剂:高糖DMEM(Gibco公司)，FBS(Gibco公司)，Matrigel(BD Bioscience公司)，PLL、CollagenⅠ(Sigma 公司)，肌球蛋白(myosin)兔抗鼠抗体(Sigma公司)，Dylight488驴抗兔荧光二抗(Jackson公司)。

2．Matrigel、CollagenⅠ、PLL 的铺制:按照表1中的溶液量分别加入24孔板，把铺制的24孔板放入CO2孵箱中过夜，然后在无菌超净台中吸出多余的液体，然后在紫外灯下照射2h，随后无菌状态下自然风干后，即可加入细胞培养。

表1 3种生长基质的铺制参数

3．细胞分化培养:C2C12细胞复苏后，用10%FBS的高糖DMEM增殖培养液传3～4代，待细胞状态良好时，用0．05%胰酶-EDTA消化后制成密度为1．5×105/ml的细胞悬液，按1毫升/孔加入各已预铺制的24孔板，CO2孵箱中过夜后，更换为2%HS的高糖DMEM分化培养基，隔天换液1次，第5日时可见大量及多核肌管形成。

4．细胞免疫荧光:常温下用冷的4%多聚甲醛将分化培养5日的细胞固定10min后，用冷的0．01mol/L PBS洗涤3×5min后，在抗血清溶液(10%FBS，0．2%Triton-X-100 的0．01mol/L PBS)孵育30min后，用 PBST按1∶200稀释的肌球蛋白一抗在室温下孵育2h。随后在PBST按1∶400稀释的Dylight 488二抗4℃避光下过夜后，PBS洗涤洗涤3×5min后，用DAPI染核后，倒置显微镜20倍物镜视野下每孔随机选取5个画面拍摄，每组3个复孔。然后计算肌管融合率。肌管融合率(%)=肌球蛋白阳性(myosin+)肌管细胞核数/同视野内所有细胞核数×100%。

5．统计学方法:采用SPSS 13．0统计软件进行独立样本t检验分析。P＜0．01为差异有统计学意义。

结 果

3种生长基质下C2C12细胞贴壁良好，分布均匀，细胞形态都比较圆滑饱满，且方向一致性好。分化刺激培养过程可见部分细胞死亡，至第2日时，细胞开始变长，成为具有两极的梭形状，仅有少量细胞融合，分化培养至第5日时，可见大量长条形肌管形成，偶有少量分叉形肌管，如图1所示，Matrigel培养融合的肌管比较粗大且方向一致性好，PLL培养融合的肌管较前两组短且多核肌管数(≥3个核)相对较低。Matrigel、CollagenⅠ、PLL 3组的肌管融合率分别为21．9% ± 4．9%、8．0% ± 2．4%、14．4% ± 3．2%，且各组之间比较均有统计学差异(P＜0．01)。

图1 3种生长基质下Myosin阳性表达的C2C12细胞(标尺100μm)

讨 论

正常情况下，哺乳动物的成年骨骼肌是稳定的组织，几乎没有细胞核的更新。然而，一旦损伤，骨骼肌具有显著的修复能力，启动快速和广泛的修复过程以防止肌肉损失。其修复的初始阶段包括肌卫星细胞迅速激活、增殖、分化、融合，导致新的肌纤维形成和重塑的收缩功能。成年肌卫星细胞是在这个过程中的一个关键要素［4］。骨骼肌纤维的修复和所涉及的不同的细胞反应的激活是高度同步的过程。骨骼肌成肌干细胞的分化需要一系列信号的调控，细胞周围基质对成肌干细胞的融合有着强烈的影响。已有研究表明，与没有细胞外基质蛋白生长的细胞相比，在Ⅰ型胶原蛋白包被的表面上生长的小鼠骨骼肌干细胞C2C12分化融合更好［5］。基质胶中生长的大鼠原代肌源性干细胞分化2天后，免疫荧光显示其Pax7、MyoD、MyoG阳性细胞数明显多于生长于Ⅰ型胶原蛋白，且其细胞形态更长、更粗、分叉多，而胶原中细胞没有分叉且相对比较圆滑［6］。同时，多聚赖氨酸也常常被用于成肌干细胞的研究之中［7～9］。

我们的实验观察这3种最常用的生长基质对C2C12细胞肌管形态及融合率的差别，其中基质胶的肌管融合率最好且肌管相对粗大，Ⅰ型胶原培养组虽然肌管融合率最低，但是其肌管的长度及多核肌管数与基质胶培养组相当，都明显高于多聚赖氨酸培养组。

基质胶从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的富含细胞外基质蛋白的基膜抽提物，主要包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、bFGF、EGF、IGF、TGFβ、PDGF、NGF［6，10］。在迄今为止确定的27个不同的胶原蛋白中，Ⅰ型胶原是纤维状胶原含量最丰富的，也是是骨骼肌纤维周围的间质细胞外基质的主要成分，同时也是肌纤维再生后结缔瘢痕组织的主要成分［11］。笔者的研究结果与Grefte等［6］研究表明在基质胶和Ⅰ型胶原培养的C2C12细胞增殖和分化的能力几乎没有差异的结果不一致，可能是由于Ⅰ型胶原的浓度或量差别，或者是由于C2C12细胞分化培养的时间不同所导致，但与其大鼠原代肌源性干细胞分化两天后肌管生成情况相符。

基质胶的主要成分包括高分子质量的层粘连带白 (800kDa)、Ⅳ型胶原(540kDa)和巢蛋白(158kDa)以及低分子质量的各种蛋白生长因子(＜45kDa)［2］。L-多聚赖氨酸目前发现有3种分子质量，即(70～150)kDa、(150～300)kDa及 ＞300kDa，分子质量越大，黏附力越强［12］。我们采用的多聚赖氨酸分子质量为(150～300)kDa，3种基质的分子质量差别也许是影响C2C12细胞肌管融合率的原因之一，此外已有研究指出生长基质的弹性对肌源性干细胞的增殖和分化有所影响，但对其肌管生成却无显著影响［1］。虽然Ⅰ型胶原培养的C2C12的肌管融合率比其余两组较低，但其肌管形态和基质胶组都比多聚赖氨酸组相对粗大，而且多核细胞数(≥3个核)相对较多，更有利于C2C12分化融合实验的相关研究，这种结果也可能是因为细胞种植在同一浓度1．5 ×105/ml，37℃ CO2孵箱过夜培养后，细胞密度能达到80%以上，然后再刺激分化培养，整个过程忽略了生长基质对细胞增殖的影响造成的。

鉴于C2C12细胞在3种生长基质中的肌管生成情况，我们建议使用基质胶作为优化培养条件，能够具有较高质量的肌管和肌管生成率，为体外骨骼肌干细胞分化融合的相关实验提供了良好的基础条件。

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