LTF基因在多种肿瘤里的表达及机制研究

诸葛小菊 陈仁聘 卢光荣 黄智铭

染色体缺失在多种肿瘤发生过程中是常见的，而且往往以一种非随机化的方式发生于某号染色体的一定区域。近来研究的热点区域3p21染色体片段上就有3个高频缺失区:CER1(3p21．3，Mb:43．32～45．74)、CER2(3p22，Mb:37．83 ～ 39．06)和 FER(3p14．3 ～p21．2，Mb:50．12 ～58．03)，这些区域存在对大多数肿瘤来说可能有望成为其或者已经是抑癌基因的缺失基因，比如 LTF、LIMD1、RASSF1A、Blu等［1］。LTF基因在多种肿瘤里的失活机制是多种多样的。本文就LTF在肿瘤内的作用和多种机制做一综述。

一、LTF基因及其编码蛋白

近来研究发现3p21．3染色体上存在对大多数肿瘤来说的候选抑癌，LTF亦是其中一员。LTF基因位于3p21．3的LUCA区中的CER1，这个区域在肺癌，鼻咽癌等多种肿瘤内表现为高频缺失区。

LTF的mRNA长约2．4kb，含17个外显子，编码乳铁转运蛋白，为转铁蛋白家族中的一员［2］。1938年Sorensen和Sorensen首次从牛乳中分离出牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin，BLF)，1960 年 Groves从人乳中首次分离出人乳铁蛋白(human lactoferrin，HLF)［3］。HLF完整的氨基酸序列由703个氨基酸残基组成，由一条多肽链折叠成两个球状小叶组成，每个小叶带有一个铁结合位点［2，4］。当一个铁离子结合到乳铁转运蛋白的同时伴随着两个碳酸氢根阴离子的结合［5］。HLF该蛋白为外分泌型，血浆HLF主要由中性粒细胞分泌，在人体支气管黏液、乳汁、泪液、唾液、胃液、精液、宫颈分泌物和鼻腔分泌物等多种体液中检测到。既往研究认为，乳铁转运蛋白仅被视为牛奶中抑菌的一种转铁蛋白，但近来的研究发现不止如此。LTF除与抗菌、抗病毒、抗真菌、抗炎和促进免疫细胞生长相关，是人类固有免疫的重要成员之一等功能外，还与细胞增殖分化调节相关，有抗氧化、抗肿瘤作用［6］。1994年Bezault等［7］发现 LTF 基因能抑制用甲基胆蒽诱导小鼠产生的纤维肉瘤和体外NIH3T3细胞株的生长，也能减少黑色素肉瘤在小鼠体内实验中的转移。自此LTF基因被视为重要的抑癌基因。有文献报道LTF的抗肿瘤的作用机制是多种多样的，可能与调节NK细胞活动，肿瘤化学预防活动，G1蛋白表达的调节，抑制细胞增殖，增强细胞凋亡相关［8］。

在动物实验中，LTF能抑制小鼠实体肿瘤的发展和代谢而起到抑癌作用［9］。LTF在多种肿瘤组织中表达下调，如鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、恶性胶质瘤、前列腺癌、口腔鳞癌等［8，10］。LTF失活的机制是多种多样的。在肿瘤里低表达的机制大致可分为基因水平相关和表观遗传学相关，前者包括杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)和基因突变，后者包括启动子甲基化和组蛋白去乙酰化修饰相关。

二、LF的抗肿瘤作用

与抗炎过程一样，LF亦能在肿瘤内调节各种细胞因子的产生和表达。Zhang等［11］研究发现LTF转染鼻咽癌细胞株后，较多细胞停滞在G1期，而相对的S期、G2-M期细胞减少，这提示在LTF介导的抑制细胞周期中存在着特殊的细胞周期调节机制。在动物实验中，用HLF重组体治疗小鼠的肿瘤模型发现，和安慰剂对比能60%的抑制小鼠上肿瘤的生长，增加有抑癌作用的细胞因子如IL-18，激活NK细胞和CD8+T 细胞［12］。近来 Giuffrè等［13］通过对比观察 LF在人肾细胞癌及癌旁组织的免疫表达发现LF有抗癌作用。同时，Wolf等［14］也有相同的结论，LF在头颈部鳞状细胞癌内能抑制T细胞依赖的肿瘤的生长。

三、LTF基因和鼻咽癌

Zhou等［15～17］在鼻咽癌组织，癌旁组织和鼻咽慢性炎症组织差异表达谱和组织芯片分析中发现，LTF在鼻咽癌里表达显著下降，而在鼻咽癌旁和鼻咽慢性炎症组织中存在高表达，几乎所有的鼻咽部腺体均能检测到LTF蛋白的存在，证实LTF蛋白在腺体中高表达、为一细胞分泌性蛋白。而且，相对早期的TⅠ期和TⅡ期鼻咽癌LTF表达阳性率为61．25%，而相对晚期的TⅢ和TⅣ期鼻咽癌组织中LTF阳性率为40．82%，并且与淋巴转移相关。提示其可能与鼻咽癌的侵袭转移和临床进展有关，为鼻咽癌候选易感基因，可作为鼻咽癌侵袭、转移和临床进展预测的分子靶标。亦有其他文献报道的LTF低表达现象，其用RT-PCR和real-time PCR方法研究发现LTF基因在76%的鼻咽癌组织中表达缺失或下调，同样支持LTF基因的低表达和淋巴转移相关，并提出LTF失活机制主要与启动子甲基化、突变和LOH有关。Zhang等［18］报道LTF基因在鼻咽癌组织和7种鼻咽癌细胞株中表达下调，而且在其6种细胞株下调与甲基化相关，另一种与LOH和基因突变相关。进一步研究发现，用去甲基化剂逆转细胞株甲基化情况后，LTF可以重新表达上调，结果提示在鼻咽癌里LTF的抑癌机制和启动子甲基化高度相关，且可被逆转，由此推测LTF基因可能在鼻咽癌发生、发展中发挥了重要作用，是一个鼻咽癌的候选抑癌基因。另有文献报道LTF在鼻咽癌细胞株CNEI、5-SF以及HNEI细胞中L能够延缓体外细胞株生长、抑制肿瘤形成［19］。

四、LTF和肺癌

Iijima等［10］系统的研究LTF在数种肺癌细胞株和原发非小细胞肺癌中的表达情况，发现LTF在16/27(59%)的小细胞肺癌(SCLC)细胞株内表达缺失;在非小细胞肺癌(NSCLC)亚型内表达缺失比例分别是，腺癌23/29(79%)，鳞癌4/5(80%)，大细胞癌3/5(60%)，恶性间皮瘤2/3(67%)。这一点与之前Finkbeiner等研究的结果LTF基因在NSCLC细胞株9/12中表达缺失一致。并且，使用去甲基化剂5氮杂胞苷处理其中的4中肺癌细胞系(NCI-H1299，-H1437，-H1666和-H2009)后，其LTF基因能恢复表达。这证明在肺癌内LTF也极有可能是抑癌基因，其表达失活机制与启动子甲基化相关，而且有被逆转修复的可能。Iijima等［10］的实验中选取其中被5氮杂胞苷处理后LTF能恢复表达的两个细胞系(NCI-H1299，NCI-H2009)和5氮杂胞苷处理后LTF未能恢复表达的一个细胞系NCI-H1264，分别用亚硫酸盐修饰DNA测序方法分析LTF 5'端14个CpG位点的甲基化情况，发现这前两个细胞系大多数位点都是高度甲基化，而NCI-H1264没有一个位点发现甲基化。测序结果发现5'端的14个CpG位点中3、4、5、6、11是与LTF基因表达相关的常甲基化位点。做过同类研究的 Yang报道4、5、9、11、12这5个CpG位点可能和和LTF基因表达相关的常甲基化位点。综合两人的意见，4、5、11这3个CpG位点有可能和LTF基因表达相关的常见甲基化位点。在肺癌中除启动子位点甲基化和LTF基因表达沉默相关外，还有一个重要的因素——组蛋白去乙酰化修饰。至于两者是否有协同作用，Maass等报道联合使用去甲基化剂和组蛋白去乙酰化抑制剂与单用其中一种治疗并没有提高LTF基因的mRNA表达，这提示启动子甲基化和组蛋白的去乙酰化修饰两者在肺癌细胞株内影响LTF表达沉默的机制是独立的。此外，肺癌内LTF基因表达沉默从基因水平上说，也与基因突变相关。表观遗传学特别是DNA甲基化的改变是各种抑癌基因异常失活的重要机制，而相关甲基化位点的发现将为去甲基化靶点提供科学依据。

五、LTF和前列腺癌等其他肿瘤

Shaheduzzaman报道在前列腺癌肿瘤细胞内LTF mRNA表达下降和患者体内的PSA表达降低相关。在前列腺癌组织和前列腺癌4种细胞系内均发现LTF启动子下游CpG岛甲基化现象。在细胞实验中，LTF蛋白的补给治疗可以减慢肿瘤细胞生长，细胞周期分析提示使用LTF蛋白治疗增加细胞凋亡。提示LTF有潜能运用于前列腺癌的化学预防，及成为其预后的生物相关分子标志物。

Sousa通过蛋白质组学的方法研究正常胃黏膜，化生胃黏膜到胃癌这个过程中的蛋白表达的特征，LTF的蛋白在胃癌降低表达，这个差异在胃癌演化过程中是有意义的。研究认为，LTF和DMBT1可以分别作为SPEM和IM(肠型化生)的强分子标志物，且LTF的低表达和胃癌的预后差相关，与分期无关。但是LTF基因在胃癌的研究中缺乏较大样本(Sousa实验中针对胃癌仅进行3个样本量的研究)的检验，其失活机制有待进一步研究。笔者通过细胞水平的验证，发现LTF基因在胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803、BGC-823中其启动子区域是高甲基化的，且这种状态与LTF mRNA在胃癌细胞株中的低表达显著相关。LTF能通过体内某些信号通路如NF-κB来激活基因的表达。目前数据显示，大多数的肿瘤中LTF越低的表达和越差的预后相关，这也支持LTF在胃癌肿瘤中起一个保护角色的观点。人类大多数肿瘤是多基因遗传性的肿瘤，这表示肿瘤的发生不是单个基因决定的，是有多个基因多个步骤不同时间空间协同发生的，是个动态的过程。利用转录组学和蛋白组学方法检测到对鼻咽癌来说的重要功能基因SPLUNC1、LTF、NOR1、BRD7、NAG7 和 LPLUNC1 等参与 Wnt/β -catenin、ras/MEK/ERK、JNK、Rb/E2F、AKT、细胞周期、p53通路、细胞外基质-受体相互作用、免疫反应相关通路以及酶活性通路。这表明包括LTF在内的抑癌基因等可能都是处于这个连锁反应的关键部位，个别基因的失活是有其他因素的诱导调控(这些因素可能是理化因素、生物因素环境因素等，也有可能是抑癌基因的时候或者癌基因的激活)，也有可能成为下一步肿瘤演变中的推动力量。这提示如果控制肿瘤形成的关键靶点，可以切断其演变的进程。

综上所述，LTF在多种肿瘤里表现为抑癌基因性质。LTF在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用，如调节NK细胞活动，肿瘤化学预防活动，G1蛋白表达的调节，抑制细胞增殖，增强细胞凋亡。但是更多的研究发现，LTF在多种肿瘤中呈现低表达，其表达失活的原因主要涉及基因水平和表观遗传学水平的调节机制。如LTF基因启动子区高甲基化，组蛋白去乙酰化修饰，杂合性缺失和基因突变。在接下来的研究中，我们应从多维度对LTF基因的抗肿瘤机制进行进一步的研究，同时靶向调控抑制其在肿瘤中的异常失活状态。

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