G试验对肾移植受者侵袭性肺部真菌感染的临床诊断价值

刘炎忠，钱叶勇，王 振，柏宏伟，常京元，范 宇解放军医学院，北京 00853；解放军第309医院 泌尿二科，北京 0009

真菌感染是肾移植术后常见的一种机会性感染。肾移植术后侵袭性真菌感染发生率为1.4% ~9.4%，病死率为30% ~ 70%[1]，其中侵袭性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infection，IPFI)居侵袭性真菌感染首位[2]；传统的真菌培养及活检虽然诊断特异性较高，但前者诊断具有延时性，后者由于其有创性也常为肾移植受者及家属拒绝。为了更快、更准确地诊断侵袭性真菌感染，近年一些新的指标被引入用于诊断侵袭性真菌感染，包括(1，3)-β-D葡萄糖检测(G试验)和半乳甘露聚糖检测(GM试验)；由于G试验可以检测出临床常见的2种侵袭性真菌感染(包括系统性念珠菌病和肺曲霉病)而被广泛用于临床检测[3]。本研究探讨G试验对肾移植受者侵袭性肺部真菌感染临床诊断价值。

资料和方法

1 病例资料 2008年10月- 2013年1月我院肾移植登记系统中127例肾移植受者，分为IPFI组(其中确诊组0例，临床诊断组24例)和非IPFI组(103例)。纳入标准：1)肾移植受者；2)所有患者均在3 d内行G试验及胸部CT检查；排除标准：1)非肾移植受者；2)患者未行G试验或胸部CT检查；3)患者虽行G试验及胸部CT检查，但两者时间差＞3 d。

2 诊断标准 参考2006年中华内科杂志编辑委员会的IPFI诊断标准(草案)[4]，临床特征：1)肺部感染的症状和体征；2)影像学出现新的肺部浸润影；3)持续发热96 h，经积极的抗菌治疗无效。微生物学检查：1)合格标本2次及2次以上培养阳性且为同一菌属；2)血液标本曲霉菌半乳甘露聚糖抗原(GM)(ELISA)检测连续2次阳性。同时具备至少2项临床特征和1项微生物学证据可诊断IPFI。

3 (1，3)-β-D葡萄糖检测 应用北京金山川科技发展有限公司的MB-80微生物动态快速检测系统及GKT-1M真菌(1，3)-β-D葡聚糖检测试剂盒(光度法)定量检测血浆中真菌(1，3)-β-D葡聚糖含量。取待测血清0.2 ml直接加入酶反应主剂中，溶解后使用微量加样器转移至9 mm×65 mm标准无热原平底试管中(不要产生气泡)，插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行反应，反应结束后检测系统自动计算出待测血清中(1，3)-β-D葡聚糖含量。厂家提供的正常参考值为＜10 pg/ml，可疑参考值为10 ~ 20 pg/ml，异常参考值为＞20 pg/ml。

4 统计学分析 应用统计软件SPSS11.0进行统计学描述及检验，IPFI组与非IPFI组的血浆葡聚糖含量为非正态分布，记录中位数M和四分位间距Q(P75-P25)，采用独立样本秩和检验(Mann-Whitney test)，P＜0.05为差异具有统计学意义。同时根据患者CT有无新发感染迹象，绘制血浆(1，3)-β-D葡聚糖含量诊断肾移植受者侵袭性肺部真菌感染的ROC曲线，根据灵敏度和特异度需要，确定血浆(1，3)-β-D葡聚糖检测对诊断肾移植受者侵袭性肺部真菌感染的最佳临界值。

结 果

1 分组情况 127例中IPFI组24例(见表1)，非IPFI组103例。IPFI组术后发生感染的时间是6 d ~10年，中位时间是2个月。15例为酵母菌属，6例为丝状真菌，1例真菌孢子，1例霉菌孢子，1例新型隐球菌；4例死亡，其中3例死于肺部真菌感染，1例死于心衰，CT表现分别为双肺炎症性改变，双肺多发斑片状模糊密度影，双肺斑片及结节状影，左下肺斑片影；IPFI组中18例胸部CT有新发感染迹象、2例胸部CT正常、3例呈陈旧性病灶、1例胸部CT改变较前相仿。非IPFI组中CT有新发感染迹象36例，无新发感染迹象67例。

表1 两组患者的临床特征Tab. 1 Clinical characteristics of two groups(n, %)

2 G试验检测结果 IPFI组24例中血浆(1，3)-β-D葡聚糖含量最高为985.4 pg/ml，最低为5 pg/ml，中位数M为79.51 pg/ml，四分位间距Q(P75-P25)为151.23 pg/m l；非IPFI组103例中血浆(1，3)-β-D葡聚糖含量最高为72 pg/m l，最低为3 pg/ml，M＜10 pg/m l，Q为6.9 pg/ml；两组血浆(1，3)-β-D葡聚糖含量差异有统计学意义(P＜0.001)(见图1)。

3 ROC曲线评估G试验诊断的灵敏度和特异度当患者CT有新发感染迹象时，血浆(1，3)-β-D葡聚糖用于诊断肾移植受者侵袭性肺部真菌感染ROC曲线下面积为0.795(P＜0.001)，95%置信区间为0.643 ~ 0.947(见图2)；诊断的最佳临界值为13.08 pg/ml，灵敏度、特异度、阳性预告值和阴性预告值分别为 0.778、0.861、0.737、0.882，(表 2)；当患者CT无新发感染迹象时，血浆(1，3)-β-D葡聚糖用于诊断肾移植受者侵袭性肺部真菌感染ROC曲线下面积为0.897(P=0.001)，95%置信区间为0.755 ~1.039(图2)；诊断的最佳临界值为38.65 pg/m l，灵敏度、特异度、阳性预告值和阴性预告值分别为0.833、0.940、0.556、0.984(表 3)。

图 1 两组葡聚糖含量的比较Fig. 1 G lucan levels in two groups

图 2 G试验诊断肾移植受者IPFI的ROC曲线Fig. 2 ROC curves for G test in diagnosis of IPFI

表2 CT有新发感染迹象，G试验诊断IPFI的灵敏度和特异度Tab. 2 Sensitivity and specifi city of G test for diagnosis of IPFI when CT show s new infections

表3 CT无新发感染迹象，G试验诊断IPFI的灵敏度和特异度Tab. 3 Sensitivity and specifi city of G test for diagnosis of IPFI CT show s no now infections

讨 论

随着造血干细胞、实体器官移植的广泛开展，高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的应用，侵袭性肺部真菌感染的发病率明显增高[5]；近年来，血清真菌细胞壁成分曲霉半乳甘露糖抗原和(1，3)-β-D葡聚糖抗原的检测，血液、支气管肺泡灌洗液中的各种真菌PCR测定，成为诊断IPFI的微生物学检测方法[6]。

(1，3)-β-D葡聚糖抗原检测方法也称为G试验。这种方法是根据Levin等[7]发明的内毒素检测法(鲎实验法)演变而来的。鲎是一类与三叶虫一样古老的动物，鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”。(1-3)-β-D-葡聚糖抗原主要是活化马蹄鲎的凝血酶原G因子，进而激活血清凝固酶原，形成凝固酶，使凝固蛋白原转变为凝胶状的凝固蛋白，整个反应可以通过光谱仪测量其光密度来进行量化[8]。

(1，3)-β-D葡聚糖是一种多糖，普遍存在于真菌的细胞壁中，其含量约占真菌细胞壁干重的50%，而且(1，3)-β-D葡聚糖在酵母样真菌中含量最高[9]，其他病原微生物如病毒、细菌、支原体等不存在该成分，因此理论上检测该成分可以对真菌感染进行诊断或鉴别诊断。患者出现侵袭性肺部真菌感染时，(1，3)-β-D葡聚糖可以从真菌的细胞壁释脱落并释入血液中，使血液中的含量明显增高。但当出现真菌定植或浅表真菌感染时(1，3)-β-D葡聚糖较少或不能释放入血液中。因此血浆(1，3)-β-D葡聚糖的含量可以作为侵袭性肺部真菌感染的证据[10-11]。

尽管(1，3)-β-D葡聚糖存在于绝大多数真菌的细胞壁，但是仍有部分真菌(如隐球菌属和接合菌属)感染无法通过(1，3)-β-D葡聚糖检测诊断，从而造成了假阴性结果[12-13]。本研究中IPFI组中有1例新型隐球菌感染患者，血浆(1，3)-β-D葡聚糖＜10 pg/ml。多项研究证实在某些物质中存在(1，3)-β-D葡聚糖类似物，造成了假阳性结果[14-15]。如中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪(人工肾，血液透析仪)洗涤液，纱布棉球等实验室污染，抗肿瘤药物中蘑菇聚糖，K多聚糖，香菇多糖或使用过免疫球蛋白等也含有(1，3)-β-D葡聚糖类似物，食物中(1，3)-β-D葡聚糖成分可以通过受损的胃肠道黏膜进入到血液中，以真菌作为原料制成的抗生素。

本研究通过单中心回顾性研究发现：检测血浆(1，3)-β-D葡聚糖用于诊断肾移植受者侵袭性肺部真菌感染时，无论患者CT有无新发感染迹象，其诊断的曲线下面积均在0.8左右，诊断均具有一定的价值。然而，单纯依靠血浆(1，3)-β-D葡聚糖检测的诊断临界值为24.29 pg/m l，检测血浆(1，3)-β-D葡聚糖联合患者CT有无新发感染迹象用于诊断肾移植受者侵袭性肺部真菌感染的临界值分别为13.08 pg/ml、38.65 pg/m l；同时联合G试验和CT检查时其诊断的灵敏度和特异度也相对更高。然而本研究样本例数不多，尤其是IPFI组中无CT新发感染迹象患者仅6例，需要进一步扩大样本量以确定更为准确的诊断临界值。

总之，G试验用于早期诊断肾移植受者侵袭性肺部真菌感染简便、有效，但在选择参考值时建议考虑到患者CT有无新发感染迹象。当患者CT有新发感染迹象时，使用13.08 pg/m l为G试验诊断肾移植受者IPFI的临界值，当患者CT无新发感染迹象时，使用38.65 pg/m l为G试验诊断肾移植受者IPFI的临界值。

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