肾小管上皮细胞凋亡与肾纤维化及中药组分的干预进展

顾 铜 李 均

(遵义医学院珠海校区研究生院，广州 珠海 519000)

中药组分可以通过抑制肾小管上皮细胞凋亡相关发生机制，进而延缓肾纤维化。目前学界对于肾小管上皮细胞凋亡与肾纤维化及中药组分的干预的研究比较多，本文从肾小管上皮细胞的凋亡发生机制、肾纤维化发病机制以及中药组分通过抑制肾小管上皮细胞凋亡相关途径，进而延缓肾纤维化三个方面进行综述。

1 肾小管上皮细胞凋亡相关发生机制

1.1触发肾小管上皮细胞凋亡的因素 各种触发细胞凋亡的因素均能触发肾小管上皮细胞凋亡，原因主要有：肾脏因子相对缺乏、生理性触发因素、细胞黏附能力下降以及细胞毒刺激〔1〕。在缺血、中毒介导的急性肾衰(ARF)中，局部、阶段性肾小管坏死并不能引起肾小球滤过率(GFR)的显著下降，而缺血、中毒刺激导致的非致命性损害在其中起到很大作用，这种非致命性损害可致肾小管上皮细胞极性丧失及单向离子转运功能受损，细胞与细胞间、细胞与细胞基质间黏附能力下降，进一步细胞凋亡，肾小管上皮细胞脱落，在管腔内形成管型，肾小管梗阻、GFR下降。当致病因素去除后，肾小管上皮细胞可完全恢复正常〔2〕。ARF动物模型，表皮生长因子EGF产生明显下降，伴随严重的肾小管上皮细胞损伤，此时若给予外源性(EGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)、肝细胞生长因子(HGF)有利于其恢复〔3〕。推测生长因子一方面可通过促进残余肾小管上皮细胞增生，另一方面可能通过抑制细胞凋亡，减轻各种刺激对肾小管上皮细胞的损害〔4〕。新近研究也证实，无论是在ARF还是在慢性肾小管间质病变中，多种生理因素触发的细胞凋亡在肾小管上皮细胞损伤中都起重要作用〔5〕。

1.2肾纤维化的发生机制 一般情况下，凋亡的细胞被吞噬，若凋亡细胞没有被及时清除，可进一步降解，细胞膜完整性丧失，乳酸脱氢酶(LDH)释放，即所谓的继发性坏死〔6〕。与原发性坏死不同的是其细胞核仍呈现细胞凋亡的特征性改变，染色体浓缩与碎裂。体内继发性坏死极其少见，主要见于凋亡细胞突出于管腔(如胃肠道、肾小管)或大量细胞凋亡已超过组织的吞噬能力〔7〕。肾小管上皮细胞的凋亡与肾小管上皮细胞的转分化分不开，在间质纤维化的进展过程中，肾小管随着纤维化的进程可肥大或萎缩，从而导致肾小管上皮细胞的凋亡〔8〕。

肾脏纤维化包括肾小球硬化与肾间质纤维化(RIF)，RIF导致肾脏损害进行性发展，几乎是所有肾脏疾病进展至终末期肾衰的共同途径，肾脏疾病的预后更多的与肾纤维化受累的程度密切相关〔9〕。目前认为，肾纤维化的发病机制主要是细胞外基质(ECM)产生与降解失衡以及成纤维细胞的增生肾纤维化的发生大致可分为三个阶段，第一阶段为诱导阶段，主要表现为炎症细胞浸润、致纤维化细胞因子释放以及成纤维细胞活化；第二阶段为炎症基质合成阶段，表现为大量ECM产生与沉积以及致纤维化细胞因子进一步释放；第三阶段为炎症后基质合成阶段，在这一阶段中，仍有致纤维化细胞因子不断产生，成纤维细胞继续增殖〔10〕。肾小管间质细胞的活化、炎症细胞浸润、血管活性物质导致纤维化细胞因子过度表达等因素，在RIF发生和发展过程中起着重要作用〔11〕。Lim等〔12〕在研究缺氧对肾小管上皮细胞的转分化作用时发现肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞可向肌成纤维细胞表型转化，参与RIF的发展。Wagener等〔13〕提出RIF的发病机制，不仅与成纤维细胞的过度生长有关，而且也与凋亡减少关系密切。

2 中药组分对内质网应激途径的调节

内质网应激是近年来发现的独立于死亡受体信号途径和线粒体损伤途径以外的一种新的细胞凋亡途径。例如，半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)作为一种位于内质网外膜的蛋白,在死亡受体或者线粒体调亡途径中不被活化。在内质网应激的过程中，Caspase-12酶原被激活为Caspase-12，活化的Caspase-12切割并且激活Caspase-9，活化的Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效应Caspase,诱导细胞调亡。因此内质网应激能触发由Caspase-12、9、3而非线粒体依赖的特异级联反应，内质网是蛋白质合成、折叠和运输及细胞钙离子储存的主要场所〔14,15〕。许多环境因素或细胞内因素，例如重要组分等都可导致细胞内质网功能障碍，直接或间接引起大量未折叠或者错误折叠的蛋白在内质网中蓄积，导致细胞处于应激状态并启动内质网应激信号转导通路〔16〕。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)作为内质网分子伴侣，参与蛋白质在内质网中的糖基化修饰，对蛋白质的折叠、装配和运输具有重要的作用，是内质网功能的关键调节蛋白，同时也是内质网应激的标志性蛋白。生理状态下，GRP78与3种内质网应激感受蛋白结合，低水平表达，当未折叠或错误折叠蛋白在内质网蓄积时，GRP78与3种感受蛋白解离，启动未折叠蛋白质反应(UPR)，UPR最基本的效应是促进细胞适应环境的变化并重建正常内质网功能。然而在过激的或者持续的刺激下，细胞适应性反应失控将诱导细胞凋亡〔17〕。内质网应激可通过多条途径引起细胞凋亡。其中，内质网源性转录因子(CHOP)，激活被认为是内质网应激促发细胞凋亡最重要的信号途径〔18〕。CHOP是内质网应激诱导凋亡的关键执行者〔19〕。

中药组分可以通过调节内质网应激途径、抗氧化、抑制凋亡相关蛋白Caspase-3、GRP78等表达，抑制肾小管凋亡的发生，进而抗肾纤维化。银杏叶提取物(EGB)是从银杏叶中提取的活性物质，其有效成分主要是黄酮苷类和萜类〔14〕。国内外的一些研究表明,EGB中所含的黄酮化合物具有明显的抗氧化和抗自由基活性，其分子中含有还原性羟基功能基团，可直接发挥抗氧化作用，EGB可以显著抑制抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人肾小管上皮细胞凋亡，其机制除了与其上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达和下调促凋亡蛋白Bax的表达有关外，可能还与它的抗氧化活性和抗自由基活性密切相关。在内质网应激的过程中，冬虫夏草干预链脲佐菌素(STZ)诱导形成的糖尿病肾病模型大鼠，能明显减少大鼠的24 h尿蛋白排泄量，延缓血清肌配升高，减轻搪尿病肾病的肾脏病理改变；纠正其血脂代谢异常、降低血中Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的水平，并能使肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、Col Ⅳ蛋白及原癌基因c-myc表达下调，具有良好的肾保护作用〔20〕。虫草能减少尿蛋白排泄，降低肾组织Ⅳ型胶原及表达，调节基质金属蛋白酶(MMP)、MMP抑制因子平衡，减轻肾小球ECM的积聚，延缓肾小球硬化的进展。冬虫夏草还可通过下调TGF-β1、Col-Ⅳ的表达，抑制肾小管上皮细胞、成纤维细胞转化为成肌纤维细胞，防治RIF。

3 中药组分对炎症细胞趋化因子分泌的抑制

在肾小管的管腔面，细胞主要受到来自小管液中过量的尿蛋白、葡萄糖、肾毒性物质、一些多肤类生长因子及活性氧等因素的刺激；在基膜面主要受到来自血液及肾间质中的单核巨噬细胞、血小板等产生的炎症因子刺激〔21〕。在这些刺激因素作用下，肾小管上皮细胞可被诱导凋亡。在RIF的过程中有大量肾脏细胞的凋亡，其中肾小管上皮细胞高表达FaS/FaSL、细胞内Bc12与Bax比值失调与其凋亡发生有关，而肾小管上皮细胞的过度凋亡可能是肾小管萎缩的原因，并参与了RIF的发生机制；或被活化，通过分泌趋化因子如炎症细胞趋化因子重组人趋化因子配体5(CCL5)和趋化因子配体10(CXCL10)等，吸引炎症细胞，参与早期的炎症过程〔22〕。

肾间质炎性反应是慢性肾脏疾病进展的一个重要因素，炎性反应程度与RIF程度直接相关。炎性浸润在间质纤维化早期即发生并贯穿整个纤维化病变过程中〔23〕。肾小管上皮细胞RTEC)是重要的间质炎性反应激活剂，是产生炎性反应介质的主要细胞。RTEC损伤后分泌单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)明显增多，被循环的单核巨噬细胞和淋巴细胞膜上的趋化因子受体识别，诱导其向间质迁移并活化。活化的炎性反应细胞分泌大量细胞因子、炎性反应介质和自由基，进一步损伤小管，诱导更多的炎性反应细胞浸润，加速RIF。浸润的炎性反应细胞加快肾脏纤维化形成和肾功能丧失，其主要机制：(1)炎性反应细胞分泌合成ECM，直接引起肾间质基质聚集。(2)单核巨噬细胞是产生促纤维化因子如TGF-β1、重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子(PDGF)的重要细胞。(3)炎性反应细胞浸润又可进一步诱发RTEC释放更多化学趋化因子，诱导更多炎性反应细胞浸润，产生炎性反应因子，损伤肾组织。(4)炎性反应细胞诱导小管细胞肌成纤维细胞转化(EMT)，并促进其分泌ECM，从而促进间质纤维化。(5)巨噬细胞产生无数的促凋亡介质如TNF、Fas/FasL杀死邻近细胞，诱导免疫性和非免疫性间质炎性反应中RTEC凋亡，导致小管萎缩。(6)纤维蛋白溶酶阳性的肥大细胞浸润数量与RIF程度有关〔24〕。

冬虫夏草(百令)及其提取液，银杏叶中提取的活性物质等能减少肾小管上皮细胞空泡变性和细胞坏死，减少间质炎细胞浸润及间质纤维化，降低小血管的透明样变性的发生率；同时也抑制TGF p在小血管的表达，减少纤维连接蛋白在球囊壁和血管的沉积。冬虫夏草可以促进体外培养的肾小管上皮细胞增生，对环孢素A(CsA)的肾小管细胞毒性具有一定的拮抗作用，在肾脏疾病中，通过阻断成纤维细胞的活化而抑制炎症反应〔25〕。经白细胞介素1(IL-1)受体拮抗剂或抗细胞间黏附因子-1(ICAM-1)抗体预处理后，能保护大鼠肾脏防止抗肾小球基底膜肾病动物模型的纤维化进一步发展〔26〕。高血压造成严重的肾脏损害时，肾组织可出现ICAM-1和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)的异常表达，酶抑制剂(ACEI)与一些中药组分可通过改变二者在肾组织中的表达状况而有效保护肾功能，延缓肾纤维化的进展。

4 中药组分抑制肾小管上皮细胞凋亡的其他途径

近年来，中医药通过抑制肾纤维化过程中 EMT发生的研究较多，主要采用中药单体、经典方剂、经验复方制剂等进行实验研究〔27〕。在内科，黄芪注射液与丹参注射液经常单独或联合应用防治肾纤维化的发生发展，但未见黄芪丹参有效组分不同比例配伍干预单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞转分化作用的相关研究。仅见赵松等〔28〕采用黄芪当归合剂，朴胜华等〔29〕采用黄芪、三七不同剂量配伍的通脉口服液进行肾纤维化治疗的相关研究。黄芪丹参配伍能针对肾纤维化病机脾肾气虚、淤血阻络而发挥补气活血之功效。李均等〔30〕认为黄芪丹参药及其有效组分不同剂量配伍对对侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化模型具有缓解作用，以组分配伍1∶1组效果最为明显。该组配伍能显著降低α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肾间质表达的阳性率，同时也能上调上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，说明该组分配伍具有良好的抑制肾小管上皮细胞间质转分化的效果，通过抑制肾小管上皮细胞的转分化，从而抑制肾小管细胞的凋亡。

Wang等〔31〕在总结肾小球疾病引起肾小管间质损伤的各种可能途径时指出，肾小球通透性的损伤导致一些物质进入肾小管腔，而这些物质对肾小管具有毒性，从而引起一系列的最终导致肾小球硬化的适应性改变。原始肾小球损伤引起肾小管间质的损伤，而肾小管间质的因素又不可避免地进展，导致肾小球的功能进一步降低，并造成肾间质的进一步损伤，如此循环，最终肾小球疾病进展至慢性过程。中药组分例如冬虫夏草等，可通过下调TGF-β1、α-SMA、Ⅳ型胶原的表达，抑制肾小管上皮细胞、成纤维细胞转化为成肌纤维细胞，防治RIF。体外研究还表明，虫草可抑制低密度脂蛋白引起的人系膜细胞增殖；抑制2型糖尿病肾病大鼠肾组织细胞凋亡发生，从而减少糖尿病RIF的发生，还能使马兜铃酸钠盐刺激的人近端肾小管上皮细胞促ECM的合成因子TGF-β1、CTGF及抗ECM降解因子人基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)、纤溶酶原激活剂抑制物1(PAI-1)的表达下调，改善马兜铃酸肾病的RIF及肾功能。

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