帕金森病模型的研究进展

裴 媛 马 进 李 姗(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 0032)

帕金森病(PD)是中老年常见的神经系统变性疾病，以黑质多巴胺(DA)能神经元的变性缺失和胞质内包涵体——路易(Lewy)小体的出现为病理特征，以静止性震颤，运动迟缓，肌肉强直和姿势步态异常为主要临床表现的疾病。目前其发病机制尚不清楚，可能与遗传因素及环境因素密切相关。左旋多巴(L-DOPA)是治疗PD的最经典药物，但有弊端。利用PD动物模型，深入探究PD的发病机制和治疗方法非常必要。现将近几年来PD动物模型的研究进展综述。

1 化学药物模型

1.1 利血平模型 利血平被用于制作PD模型始于20世纪50年代〔1〕。腹腔注射利血平后，大鼠出现了少动、骨骼肌僵硬、震颤、姿势异常等表现及神经末梢DA水平的显著下降，而这种表现又可被L-DOPA缓解。其机制可能是利血平抑制了去甲肾上腺素能神经元末梢的再摄取，使囊泡内多巴胺以及其他儿茶酚胺类递质耗竭所致〔2〕。模型在小鼠、兔、几内亚猪、猫和猴等动物身上也得到验证。该模型的最大贡献是揭示了LDOPA为PD的治疗药物，其主要缺点在于利血平只能短暂模拟PD的症状，且不能完全复制PD的病理变化，該模型可用于纹状体多巴胺替代物如L-DOPA和多巴胺激动剂的治疗效果研究。

1.2 6-羟基多巴胺(6-OHDA)模型 6-OHDA的化学结构与DA相似，在脑内被误认为神经递质摄入到神经元内，而导致DA能神经元死亡。其作用机制有:①直接造成儿茶酚胺类神经元的损伤或通过竞争DA能神经元的摄取;②形成羟自由基造成损害;③作为线粒体呼吸链的阻滞剂，破坏DA能神经元的线粒体功能。它不能透过血脑屏障，须脑内注射给药。Ungerstedt〔3〕将6-OHDA注射到大鼠脑内，成功地建立了PD模型。之后被应用于小鼠、猫、狗和猴等动物。因6-OHDA注射部位及剂量的不同，可制成不同的PD模型:完全损伤和部分损伤模型。完全损伤模型神经元多为急性坏死，呈晚期PD特征。持续小剂量单侧纹状体注射或小剂量多靶点注射，可制成早、中期部分损伤的PD模型，更接近于人类〔4〕。

该模型在生化和病理上与人类PD有很多相似之处，但未模拟出PD患者主要临床表现及Lewy小体病理特征性改变。然而该模型一经问世，因鼠源容易，价格便宜，出现的行为改变稳定而持久，便于观察，而被广泛应用;另外该药物诱发的旋转行为可进行量化评价，使该模型成为目前唯一一种可以对模型动物行为变化进行量化检测的模型，而被更广泛地应用〔5〕，是目前应用最多的PD模型之一。

1.3 去氧麻黄碱(METH)模型 METH主要作用于DA神经末梢，使DA水平明显下降，而对黑质神经元胞体影响甚微，这与利血平相似〔6〕。目前其作用机制尚不太清楚。Sonsalla等〔7〕研究提示它可能是通过DA受体和转运体而发挥作用。Virmani等〔8〕则认为它对DA能神经元的毒性作用可能是由过氧化亚硝酸盐的产生为介导所致。该模型是一个急性模型，无DA能神经元及Lewy小体的病理改变，多被用于从生化和生理方面进行PD纹状体DA水平下降的研究。

1.4 3-硝基酪氨酸(3-NT)模型 3-NT是氧化应激相对特异的标记物，包括PD在内的数种神经退行性疾病病人的脑内3-NT水平升高〔9〕。给小鼠纹状体内注射游离型3-NT，可引起纹状体TH阳性神经末梢减少，黑质多巴胺能神经元减少及行为学的异常，提示3-NT可导致神经退行性改变〔10〕。3-NT模型为急性模型，存在着局限性;模型中蛋白质聚集和细胞内包涵体的出现是否与PD有关尚不清楚。然而该模型作为氧应激PD模型，对深入探讨PD发病机制和治疗方法具有一定的作用。

2 生物毒性物质模型

2.1 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)模型 MPTP是一种人工合成的海洛因中间产物，1982年美国一青年服用了被MPTP污染的药品后，出现了类似PD的症状，尸检证实有黑质的损伤〔11〕。MPTP呈高度脂溶性，易透过血脑屏障。MPTP进入脑内，在单胺氧化酶B(MAO-B)的作用下，转化为甲基-苯基吡啶离子(MPP+)，MPP+具有强大的毒性作用，其化学结构与DA相似，被DA能神经元主动摄取后，通过以下:MPP+抑制线粒体复合物Ⅰ活性，阻断线粒体氧化呼吸链，引起ATP的耗竭;氧自由基生成增加和自由基清除剂谷胱苷肽的含量减少;一氧化氮合酶(NOS)活性增加使细胞内一氧化氮(NO)含量增加等机制〔12，13〕导致DA能神经元变性、死亡。MPTP适用于小鼠、猫、灵长类和蛙等脊椎动物及水蛭和蜗虫等无脊椎动物的造模，尤适用于小鼠和非人灵长类动物，大鼠对MPTP不敏感〔14〕。给药途径有皮下、腹腔、静脉、动脉或肌肉注射等。不同剂量的MPTP和不同的给药方法(急性或慢性，单侧或双侧)被应用于不同的实验研究〔15〕。MPTP模型有PD症状及DA能神经元选择性损伤，但无Lewy小体特征性病理改变。利用MPTP制作的灵长类PD模型，在症状、生化、病理及药物治疗反应(包括不良反应)方面均与人类PD相似且稳定，此模型优于6-OHDA模型，是研究PD最普遍使用的模型。但该动物来源少、费用高、管理不便;如为双侧损伤模型，因进食饮水困难，需用抗PD药物维持其存活等影响了其广泛应用。而小鼠模型，其病变通常是急性且可逆的，无缓慢进展的发病特点，但因其经济和方便而常被采用。

2.2 鱼藤酮模型 鱼藤酮是一种从植物中提取的天然有机杀虫剂，能透过血脑屏障，可选择性抑制脑细胞内线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，造成线粒体功能障碍及能量供给不足并产生大量氧自由基，使对氧化应激具有高敏感性的黑质-纹状体DA系统变性损伤〔16〕。该模型制备较复杂，须先将渗透微泵埋入大鼠背部皮下，再从下颌角静脉插管与微泵相连，然后灌注鱼藤酮，1/d次，连用5 w。大鼠可出现运动障碍、屈曲体姿、步态不稳，有时伴强直、震颤等表现以及DA能神经元变性和类似Lewy小体的 α-synuclein阳性包涵体等 PD病理特征性改变〔17〕。

该模型的神经毒素来源于自然环境，其慢性暴露的制作方式能较好地模拟PD发病过程，在发病机制、行为改变、生化、病理等方面均较好地模拟了人类PD的相关特征，对研究环境因素与PD病因、病机之间的关系具有独特的价值;其慢性、进行性病程特征很适合PD的神经保护治疗研究;其出现的包涵体成为研究Lewy小体形成机制的有效工具。然而，该模型制备难度大，费时费力，不同动物个体，制备效果差异性大(有些动物无明显毒性效应)，成功率低，且鱼藤酮与MPTP和6-OHDA一样，双侧损伤的模型动物存活率低，这些都限制了该模型的应用。

2.3 甲基苯丙胺模型 甲基苯丙胺是具有潜在成瘾性的神经兴奋剂，像利血平一样，可导致DA能神经末梢DA的耗竭，而对黑质神经元损伤较少，大剂量皮下注射，对啮齿类动物和非人灵长类动物具有神经毒性作用〔18〕。模型动物在用药后初始见活动过多，随之很快出现运动减少、颤抖等行为异常，黑质和纹状体中的酪氨酸羟化酶(TH)活性降低，DA含量减少，但其神经元无明显丢失。该模型是一个急性损伤模型，症状短暂且不稳定，也无Lewy小体特征性病理改变，主要用于研究PD多巴胺耗竭后的纹状体生理、生化学改变，也可用于神经保护方面的研究〔19〕。

2.4 除草剂模型 除草剂百草枯(PQ)结构与MPTP的活性代谢物MPP+相似，也是线粒体复合物Ⅰ抑制剂，增强氧应激，但作用机制与MPP+不同〔20〕。PQ可透过血脑屏障，持续低剂量予以PQ，可引起黑质纹状体DA能神经元的损伤，并可能促进神经系统退行性改变〔21〕。造模时PQ常与另一种除草剂代森锰(Maneb)合用。Maneb与PQ合用具有协同作用，能够减低运动功能和增强MPTP毒性，可能引发PD〔22〕。腹腔注射PQ和Maneb后，小鼠出现了剂量依赖性多巴胺能神经元的减少及随意运动的减少〔23〕。该模型在研究环境因素对PD发病机制、生物化学的影响上具有一定的价值;但其暴露方式与实际环境因素作用方式有明显差别，故其一些特性尚待进一步研究。

2.5 脂多糖(LPS)模型 LPS是一种强力炎症反应诱导剂，在大鼠脑黑质或纹状体定位注射微量的LPS后〔24〕，可通过激活小胶质细胞，继而引起促炎细胞因子和氧自由基的大量释放，而诱导时间依赖性的DA能神经元损伤、凋亡。LPS模型是研究小胶质细胞介导的炎症反应对PD发病机制影响的理想模型，其不足之处是造模周期较长。

3 蛋白酶抑制剂模型

PD以及其他神经变性疾病可能是一类蛋白降解障碍疾病。诸多学者应用蛋白酶体抑制剂建立了PD模型。常用的蛋白酶体抑制剂有:天然化合物 lactacystin〔25〕、epoxomycin〔26〕和合成化合物PSI、MGI32。前者普遍存在于土壤、花园农田等水生环境中;后者是合成的、可逆的蛋白酶体抑制剂，也存在于环境当中。

3.1 整体动物模型 蛋白酶体抑制剂模型多采用啮齿类动物(大鼠、小鼠)，少数采用猴子等灵长类动物。McNaught等〔25〕首次采用lactacystin脑黑质定位注射制备了PD模型，大鼠出现了典型的PD症状，剂量依赖性黑质DA神经元的变性死亡和α-synuclein染色阳性的类Lewy小体的典型PD病理特征，提示异常蛋白的降解和清除受损是PD发病的重要机制。Fomai等〔26〕采用lactacystin和epoxomycin进行脑纹状体定位注射建立的PD模型提示，蛋白酶体抑制剂对DA能神经元的选择性毒性作用与DA有关。梅加明等〔27〕将lactacystin注射到单侧脑黑质致密部后，诱导出的PD模型大鼠出现渐进性的行为学变化。

McNaught等〔28〕又采用epoxomycin腹腔注射或PSI皮下注射方法，使大鼠产生了进行性的类似PD症状，提示大鼠接受天然或合成蛋白酶体抑制剂后可再现PD的主要特征，环境中的蛋白酶体抑制剂可能是环境易感者或老年人患PD的原因。但对此全身给药造模方式一些学者提出疑义。Bove和Manning-Bog等〔29，30〕对大鼠或小鼠皮下注射蛋白酶抑制因子Ⅰ(psⅠ)，均未能复制出PD的行为学及病理学特点。Kordower等〔31〕应用此方法，在猴子身上也未获成功。针对上述争议，McNaught等〔32〕分析动物种类、药物、实验室客观条件等方面原因，重新验证了腹腔注射epoxomicin和皮下注射PSI复制PD特征的可行性;同时还发现大鼠口腔内应用epoxomicin及小鼠系统应用PSI均能够模拟出PD的行为学和病理学改变。Hawlitschka等〔33〕对大鼠皮下注射PSI，亦未成功，但却发现在大鼠的嗅球及外周肾上腺髓质TH阳性细胞数目增多，推断PSI不能透过血脑屏障，否定全身给药能复制出PD模型。目前这些结论尚待进一步验证。

3.2 体外细胞模型 Rideout等〔34〕较早地应用蛋白酶体抑制剂建立了PD细胞模型，他将lactacystin和PSI作用于裸12细胞和神经生长因子(NGF)分化后的肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞，出现了剂量相关的细胞死亡，而caspase可抑制该死亡;模拟出了Lewy小体和细胞凋亡，但该Lewy小体与患者Lewy小体有较大的区别。Reaney等〔35〕研究发现将 PSI、lactacystin、epoxomycin及MC132蛋白酶抑制剂作用于原代大鼠中脑细胞后，其对DA能神经元的神经毒性远比对γ-氨基丁酸神经元的毒性大。McNaught等〔36〕将 lactacystin及泛素醛(UbA)应用于胎鼠中脑神经元细胞后，均出现了剂量相关的DA能神经元退行性改变和包涵体。而张磊等〔37〕将PSI作用于PC12细胞，复制出了细胞凋亡和类Lewy体样小体这两大PD病理特征。

蛋白酶抑制剂建立的PD模型的最大优点是:天然环境因素致病，慢性发病过程，其行为学改变、DA能神经元变性和Lewy小体的形成与人类PD最相似，更接近于临床。因此该模型的建立，为PD的研究开辟了新的广阔前景。

4 基因模型

PD患者中约10%的患者有家族史，遗传因素仅在家族性PD患者中才起关键作用。目前已发现PD致病基因包括:αsynuclein、Parkin、ubiquitin、c-teiinal hydrolase L1 等。α-synuclein是Lewy小体的主要成分，它的异常可导致家族性PD多巴胺能神经元的变性，研究者较多。

4.1 转基因模型 Feany等〔38〕通过转基因技术，制作了表达α-synuclein的果蝇(Drosophila)PD模型，模拟出与年龄相关的多巴胺能神经元的减少，Lewy小体形成及运动功能障碍，用于研究新蛋白在PD发病机制中的作用。Masliah等〔39〕发现高度表达人类α-synuclein的转基因模型小鼠，具有PD部分特征:如细胞质和核内与α-synuclein、ubiquitin相关的包涵体，纹状体内TH活性减低及运动障碍等，但与人类PD不同的是，黑质内DA能神经元无变性缺失。Legare和 Lindsten等〔40，41〕也建立了小鼠转基因PD模型，前者为携带神经突变体NM3的小鼠模型，小鼠出现类似PD症状的行为学变化;后者为用于分析泛素/蛋白激酶系统变化的转基因小鼠PD模型。Kirik等〔42〕利用腺病毒相关病毒为载体介导α-synuclein基因转染，建立灵长类-狨PD模型。

4.2 基因敲除模型 Goldberg等〔43〕建立的Parkin基因敲除模型小鼠并未出现明显的PD症状和病理改变，这可能是小鼠在基因敲除后的成长过程中产生适应性改变所致，或许在胚胎发育成熟后再敲除Parkin基因能够出现明显的PD改变。Kim等〔44〕制作的DJ-1基因敲除模型小鼠出现了与MPTP介导的纹状体去神经化和DA能神经元损失相似的特征。Battaglia等〔45〕首次研制了转谷氨酰胺酶2(TG2)基因敲除小鼠模型，发现其整个前脑和纹状体中出现了线粒体复合物Ⅰ活性降低的同时伴复合物Ⅱ活性增高，此模型为研究TG家族在PD发病中的作用打下了基础。

PD基因模型的建立为研究PD相关基因的致病机制、环境因素与遗传因素相互作用奠定了良好的基础，提供了良好的研究手段。但该模型存在着一定的局限性:并不是所有的基因模型都能出现黑质多巴胺神经元变性等PD特异性病理改变;在人类PD是变异的基因，在小鼠中可能是正常基因;且该基因模型制作过程复杂，技术条件高，费用昂贵等因素限制了模型的发展。

5 其他模型

5.1 脑炎病毒感染大鼠PD模型 Hamaue等〔46〕通过对大鼠感染日本脑炎病毒(JEV)建立了PD模型，用以进行内源性单胺氧化酶抑制剂对PD大鼠运动迟缓及多巴胺水平改善作用的研究。

5.2 Fe3+大鼠PD模型 有专家〔47〕应用Fe3+建立了PD模型，大鼠在单侧脑黒质注射Fe3+3 w后，出现了自主运动减少，短暂僵直及自发同侧旋转等行为学改变，并出现同侧纹状体多巴胺含量减少95%，TH阳性表达细胞大量减少，胶质细胞明显增生等病理改变。

5.3 机械损伤大鼠模型 机械损伤内侧前脑束(MFB)可以造成黑质内多巴胺能神经元进行性死亡。Brechnell等〔48〕据此建立了PD模型，10 w黑质内多巴胺能神经元死亡达70%。Lapchak等〔49〕认为该模型良好，其DA能神经元的损伤是渐进性的，且定位准确，对其他脑区损害小。梁西彬等〔50〕用此法建立了部分损伤的PD模型，术后2 w动物出现了明显的行为学改变，多巴胺含量降低了40% ～50%，并模拟出了PD病理变化的全过程。机械损伤PD模型早期损伤程度不稳定，主要应用于神经元的再生研究以及各种预防或延缓神经元变性的治疗研究。

综上，众多学者从PD的发病机制入手，建立和研制了不同的PD动物模型，各个模型各具特点。其中，6-OHDA大鼠PD模型和MPTP灵长类PD模型是比较成熟的PD模型，但都未模拟出PD典型的病理特征-Lewy小体;鱼藤酮能够诱导大鼠的黑质纹状体选择性变性和胞质包涵体，但造模过程费时费力，效果不恒定;蛋白酶抑制剂PD模型既能模拟其慢性过程、行为学改变，又能模拟出其典型的病理特征，是目前新的、较理想的动物模型。在实验中采用何种模型，可根据各自的研究目的而选择。相信随着PD发病机制研究的逐步深入，PD动物模型的建立将日臻完善。

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