红细胞膜软骨寡聚基质蛋白抗原抗体力学检测在膝骨关节炎早期诊断中的作用

刘世海 郑海萍 邓 旭 张红兵 林绍仪 (佛山市顺德区乐从医院骨科，广东 佛山 528315)

骨关节炎(OA)临床症状表现为关节疼痛，慢性功能受损，严重影响了中老年人的生活质量。如何早期诊断、预防和治疗OA成为临床医生近年研究的热点也是重点。由于早期诊断缺乏特异性，因此学者寻求关节软骨新陈代谢所释放的生物学标记物间接判断OA软骨病变的程度、预后和评价疗效。本研究我们采用原子力显微镜(AFM)探针修饰上软骨寡基质蛋白(COMP)抗体，探测早期膝骨关节炎(KOA)患者以及KOA高危人群血清红细胞膜COMP抗原之间的相互作用力，研究OA亚临床期与早期病变程度与血清红细胞膜上COMP引发的细胞力学特性改变之间的关系，探讨COMP在OA早期发病中所起的作用及AFM用于临床上早期诊断KOA发病的可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2005年1月至2012年6月在我院骨科治疗的早期KOA患者62例。其中男性22例，平均年龄(52.45±9.34)岁;女性 40例，平均年龄(60.26±10.12)岁。KOA的诊断依据美国风湿病学院膝骨性关节炎诊断标准〔1〕将所摄X线片将KOA分为6级。其中早期OA的X线为1级。早期OA组在门诊行口服药物治疗。有膝关节酸痛，伴有膝关节肿胀，活动后疼痛缓解，无X线改变的KOA高危人群12例。其中男性4例，平均年龄(45.86±7.48)岁;女性8例，平均年龄(49.48±8.05)岁。随访3年，发现9例转归为KOA早期患者，3例未出现病变并入正常对照组。所有病例均排除肝肾疾病、内分泌疾病、严重的心血管疾病及肿瘤疾病患者。正常对照组5例，均为女性，平均年龄(51.47±8.70)岁，均无膝痛病史，X线片未见有膝关节病变。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有受试对象空腹抽取静脉血2 ml。离心后取上清液置－70℃保存待测。

1.2.2 采用ELISA法检测血清COMP水平 所有样本均用PBS缓冲液5倍稀释，吸取50 μl样品、已稀释样品和质控品分别至每孔，加入50 μl已稀释的酶标抗体后，室温孵育2 h，洗板6次，拍干液体后，加50 μl的亲和素-HRP，再次孵育15 min，洗板3次后每孔加入酶基质TMB，孵育15 min。加100 μl H2SO4中止反应，酶标仪在450 nm处测定吸光度值。根据标本的OD值在标准曲线上查出COMP的浓度。

1.2.3 红细胞标本的制备 受试对象均空腹12 h以上，于清晨采集外周静脉血 2 ml。肝素锂抗凝，1 000 r/min离心10 min，PBS缓冲液重悬并洗涤除去血浆和棕黄色血膜层，最后用PBS重悬并稀释，少量滴于盖玻片上。2.5%戊二醛固定20 min，三蒸水缓慢冲洗除去戊二醛和盐分，风干待用。

1.2.4 AFM针尖修饰 将浸泡在丙酮中的AFM标准针尖用紫外光照射去除针尖上的杂质，然后将针尖浸于生物素化的牛血清白蛋白溶液中，室温放置过夜，PBS反复冲洗，再将针尖浸泡在50 μl链霉亲和素中，室温下放置1 h，PBS再次冲洗。最后将针尖浸泡在100 nmol/l的生物素化的COMP单克隆抗体溶液中4℃反应过夜，取出后再用PBS冲洗，就可得到Bio抗人COMP单克隆抗体修饰的针尖。在AFM力谱测量实验中可直接使用制备好的针尖。

1.2.5 AFM的样品制备、成像 将制备好的样品固定在AFM的XY扫描台上，用监视器定位所要扫描的样品区域，在空气中室温下利用接触模式成像。采用100 μm扫描器，UL20B硅探针，力常数为2.8 N/m，AFM图像经自带软件平滑处理，以消除扫描方向上的低频背景噪音。利用AFM力位移曲线测量系统在同一loading rate下测量得到力的曲线进行力的统计分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，采用成组t检验进行组间比较。采用One-way ANOVA分析方法比较三组红细胞黏附力和硬度。数据以s表示。

2 结果

2.1 三组血清COMP含量的比较 KOA高危组血清中COMP含量〔(7.83±2.27)pg/ml〕与正常组差异无统计学意义〔(6.06±1.65)pg/ml，P＞0.05〕。KOA 早期患病组血清中COMP含量〔(12.35±3.74)pg/ml〕均显著高于正常组及KOA高危组(P＜0.05)。

2.2 三组红细胞力学特性的比较 对三组细胞力学性能进行研究，KOA早期患病组、KOA高危组与正常组红细胞COMP抗原抗体间特异性黏附力之间相互比较差异显著(P＜0.05)。正常组的黏附力为(202±32)pN，KOA高危组黏附力为(313±39)pN，明显高于正常组。而 KOA早期患病组为(510±57)pN，比上述两组均高。正常组、KOA高危组、KOA早期患病组弹性模量分别为(1.53±0.23)、(2.19±0.33)、(2.85±0.45)kPa，三组弹性模量相互比较也均有显著性差异(P＜0.05)。KOA早期患病组明显高于其他两组。

3 讨论

通常KOA的诊断主要依据病人的主观主诉，如关节疼痛、活动障碍等，结构的测量，如膝关节X线、MRI以及通过关节软骨新陈代谢所释放的一些生物标记物的检测。X线、MRI是传统的也是常用的KOA诊断方法，它们同时可以预测疾病进展和指导治疗。但X线不像骨疾病诊断那么直观，对于OA它只是提供了间接的病理学信息，例如关节间隙变窄，骨侵蚀、骨赘形成、骨硬化或骨量减少以及软组织肿胀等。而且对于KOA疾病发生的早期X线征象不明显，X线与患者关节功能改变的相关性不大〔2〕。所以寻求生物学标记物，例如软骨来源的分子或肽片段，对于OA早期诊断、OA有效防治及疾病严重性评估就显得尤为重要及迫切。这些标记物的生化检测相对于X线和MRI，可以提高OA诊断的准确性和敏感性，减少患者费用〔3〕。但我们同时更要考虑到早期诊断的特异性。

OA潜在的生物标记物包括小型元件、细胞因子、生长因子、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、针对软骨组分的血清自体抗体〔2〕。其中COMP是一种细胞外钙结合蛋白，属于血小板反应蛋白家族〔4〕。虽然它的特定功能仍不明确，但它通过与胶原纤维及基质成分的交互作用，组装及稳定软骨细胞外基质，具有软骨组织特异性〔5，6〕。软骨损伤发生后，COMP最先释放进入关节液中，随后扩散进入血液中，通过尿液排泄〔7〕。所以关节液和血清中COMP水平可以反映关节软骨的损害程度和炎症程度〔8，9〕。

既往研究表明，OA患者关节液COMP水平明显高于正常对照组。Clark等〔10〕报道KOA患者血清COMP水平明显高于对照组。Vilim等〔11〕认为血清COMP水平与关节间隙改变相关。Sharif等〔12〕进一步研究阐明COMP水平与KOA关节损害进展相关。以上研究表明COMP可以作为关节退变的一种检测手段，血清或关节液COMP的检测能提高OA诊断的准确性〔13〕。但传统的研究认为COMP水平只适合血清检测，因为关节液由于透明质酸和蛋白成分的存在导致了高黏滞性，增大了分析难度。而且我们回顾上述文献研究报道并未发现血清COMP在OA早期诊断中的提示作用，研究者关注的是血清COMP在OA早、中、晚期患者疾病预判上的效果。其实对于OA高危人群，我们更应该关注，如果能及早发现这类人群的转归，对于尽早采取防治措施和指导早期治疗意义重大。

本研究说明血清COMP检测无法区别OA高危人群与正常人群，无法早期预判OA的发生，不具备早期诊断OA的条件。运用AFM探针修饰上COMP抗体检测与红细胞膜上COMP抗原间相互作用力，这种方法能找出OA高危人群，及时预判这类人群的转归，及早指导及预防或延缓OA的进展，为寻求药物治疗这类人群提供实验依据和数据。

疾病发生必然伴有细胞结构与功能改变，临床上的一些检测都只是从宏观角度观察和认识疾病的进程，无法获得微观的信息，而这些无法用肉眼看见的微观变化正是功能改变的关键性因素。本研究我们采用纳米技术在微观领域上探讨OA高危人群与正常对照人群红细胞膜上COMP抗原抗体作用力，发现两组间有显著性差异，说明我们可以运用AFM修饰上COMP抗体进行OA初筛。红细胞容易获取，患者易接受并配合检查，故这种方法值得广泛推广。只是AFM暂时仍作为科研设备未普遍进入临床中使用，本试验我们正是和暨南大学测试中心合作完成。但我们相信在不久的未来，将建立高校与基层医院的合作体系，标本检测更迅捷、方便。毕竟这项检测的开展有利于早期预知OA。

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