何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺端粒酶活性的影响

葛志华 李俊玫 李俊颖 于海忠 杨 宁 王春艳

(承德医学院附属医院科研处，河北 承德 067000)

70%唾液和近50种生物活性物质由下颌下腺分泌〔1〕，研究发现老年患者出现口干症状可能与衰老导致下颌下腺腺泡和导管细胞内超微结构改变，外分泌功能明显降低有关〔2〕。本研究所用何首乌饮由《宣明论》何首乌丸加味而成(炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓),具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。研究发现，何首乌饮可使衰老大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力明显升高，总抗氧化能力(T-AOC)增强，丙二醛(MDA)显著降低；可改善衰老大鼠下颌下腺超微结构的衰老变化、抑制细胞凋亡而达到延缓细胞衰老、凋亡的目的〔2～5〕。近年发现细胞衰老与细胞内染色体末端端粒长度密切相关，端粒酶再激活被认为是细胞逃脱衰老的重要机制。本文观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺端粒酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 何首乌饮方剂所用中药购自承德富尔康药业有限公司；端粒酶活性检测TRA-ELISA试剂盒，Roche公司；D-半乳糖，北京化学试剂公司；细胞裂解试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2实验动物的选择及分组 选用8周龄清洁级SD雌性大鼠20只，体重180～220 g，购自河北省实验动物中心。将大鼠随机分为正常组、模型组、何首乌饮预防组、何首乌饮治疗组每组5只。

1.3模型的建立及各组动物的处理方法 正常组正常喂养60 d；模型组腹腔注射D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1，连续 60 d；何首乌饮预防组称重后腹腔注射D-半乳糖(量同模型组)同时灌胃何首乌饮1.936 g·100 g-1·d-1，水煎浓缩成0.6 ml·100 g-1·d-1，1次/d，连续60 d。何首乌饮治疗组大鼠称重后腹腔注射D-半乳糖(量同模型组)60 d后，灌胃何首乌饮1.936 g·100 g-1·d-1，水煎浓缩成0.6 ml·100 g-1·d-1，1次/d，连续60 d。各组大鼠末次给药后1 h，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，分离并摘取下颌下腺，置液氮中保存备用。

1.4采用端粒重复扩增-微孔板杂交法检测下颌下腺细胞端粒酶活性 取100 mg(-70℃ )冷冻下颌下腺组织，经洗液漂洗、离心沉淀后加200 μl冷裂解液，自动匀浆器冰浴中匀浆，离心、移取上清液，-70℃保存。端粒序列的复制及TRAP扩增：每管加入约5 μl的细胞裂解液，25 μl混合物，5 μl内标引物,用无DNAase的双蒸水补至50 μl；25℃ 反应30 min，合成端粒酶延伸产物。然后加热灭活端粒酶，加入0.1 μg CX和2 μl Taq酶进行PCR反应。产物的固相与杂交(包被、变性、杂交与显色)取样品和内参对照PCR产物各2.5 μl于96孔板上，同时设空白裂解液和样品灭活的对照，每孔加入10 μl变性液，样品一分为二，分别加入100 μl杂交液T或100 μl杂交液IS，混合后，加入预处理过的96孔板中，封口，37℃ 300 r/min 2 h；吸去杂交液，用洗涤液洗3次，加入Anti-DIG-HRP工作液，300 r/min，室温30 min；去杂交液。洗5次，加入TMB底物溶液，300 r/min室温20 min；最后加入终止液，在30 min内于450 nm处测吸光度值，按公式计算端粒酶的相对活性。

1.5统计学方法 采用SPSS11.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

正常组、模型组、何首乌饮预防组、何首乌饮治疗组间端粒酶活性OD值(0.28±0.51，0.03±0.06，0.26±0.21，0.11±0.01)表达比较，差异有统计学意义(P<0.01)。多重比较结果显示，模型组端粒酶OD值最低，正常组最高，何首乌饮预防组低于正常组，但高于其他各组(P<0.01)。

3 讨 论

唾液具有消化功能和润滑、防御、保护、抗菌及内分泌作用。随着年龄增长，下颌下腺会出现增龄性变化，唾液流量及成分亦将产生明显的变化，致使唾液量减少而黏稠，导致口干，进而影响咀嚼和吞咽；防御、保护和抗菌作用减退可成为涎腺炎、蛀牙、牙周疾病和持续的口腔感染的影响因素〔6〕；衰老还可影响下颌下腺分泌生物活性物质〔如神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)等〕的功能，继而引起其他一系列继发性变化。因此，下颌下腺的抗衰老研究对衰老病人的涎腺功能减退性疾病的预防、治疗具有重要意义。

近年发现细胞衰老与细胞内染色体末端端粒长度密切相关，端粒存在于真核生物线形染色体末端，由串联重复的短 DNA序列及其相关蛋白组成 DNA蛋白复合体。主要作用为防止染色体 DNA 降解、 末端融合缺失和非正常重组。端粒酶具有促进端粒延伸的作用，在没有端粒酶的细胞中，端粒会逐渐缩短直至染色体损伤；有端粒酶存在的细胞，则端粒的长度能得以保持，使之处于一种不断伸缩的动态平衡中〔7〕。在端粒酶处于抑制状态的细胞分裂时，DNA 不完全复制会引起端粒DNA的少量丢失，随着细胞分裂次数的增加，端粒不断缩短。当端粒缩短到一定程度(临界长度)时引发 Hayflick 极限，细胞不再分裂增殖而衰老死亡〔8〕。因此，端粒酶再激活被认为是细胞逃脱衰老的重要机制。

结果提示，组织端粒酶活性的下降是导致衰老的原因之一，而何首乌饮可提高衰老大鼠下颌下腺端粒酶活性，延缓端粒缩短。

中医学认为脾肾两虚夹瘀是衰老的基本病机,作用于衰老的全部过程，脾肾两虚是衰老的本质，而瘀血的病理产物则是衰老在脾肾两虚的前提下的必然结果。何首乌饮具有乌发，填精补髓功效。在此基础上加淫羊藿补肾阳，强筋骨，丹参活血化瘀、养心安神，茯苓健脾化湿，以达到补肝肾、益精血、延年益寿之功效。已有研究显示〔9，10〕何首乌饮方剂能延缓衰老大鼠卵巢细胞及肾脏细胞凋亡的发生。而本研究结果显示何首乌饮延缓衰老的机制可能与其增加组织的端粒酶活性有关。

4 参考文献

1何江才，姚国刚，贾雪梅.下颌下腺内生物活性物质的研究进展〔J〕.四川解剖学杂志，2000；8(4):217-21.

2葛志华，赵淑敏，杨桂梅，等.何首乌饮对 D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺超微结构的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009； 29(14):1778-80.

3葛志华，孙立新，杨桂梅，等.何首乌饮对实验性衰老大鼠下颌下腺 T-AOC、MDA的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(1):105-6.

4葛志华，许 倩，王春艳.何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺GSH-PX、MDA的影响〔J〕.现代预防医学，2011；38(51):850-6.

5李俊玫，高福禄，葛志华，等.何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺凋亡的影响〔J〕.山东医药，2009； 49(48):34-5.

6Napenas JJ，Brennan MT，Fox PC.Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth)〔J〕.Odontology,2009;97(2):76-83.

7张 婷，王晓民.端粒、端粒酶的发现和意义〔J〕.首都医科大学学报，2009；30(5):718-22.

8马 宏，张宗玉，童坦君.衰老的生物学标志〔J〕.生理科学进展，2002；33(1):65-8.

9陈 雪，牛嗣云，曲银娥，等.何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响 〔J〕.时珍国医国药，2009；20(3)：650-1.

10李亚丽，周利霞，张 娜，等.何首乌饮对亚急性衰老大鼠卵巢细胞凋亡及相关基因表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009；29(3):265-7.