D-半乳糖诱发的衰老对大鼠下颌下腺端粒酶活性的影响

葛志华 李俊玫 于海忠 孙立新 杨 宁 杨佳宁 李俊颖

(承德医学院附属医院科研处，河北 承德 067000)

端粒酶学说是目前比较公认的细胞衰老分子机制的主流学说之一。该学说认为端粒是真核细胞染色体末端的DNA重复序列，对染色体的稳定和DNA完整复制起重要作用。通常认为当染色体端粒DNA因分裂而缩短到临界长度时，细胞的内在机制发生作用而不能再分裂，进入衰老。而端粒结构是由活性端粒酶来维持的〔1～3〕。因此，端粒酶再激活被认为是细胞逃脱衰老的重要机制。以往的衰老研究，一般多集中在心、肝、脑、肺、肾、生殖器等重要的脏器，而关于下颌下腺组织增龄性改变的研究资料少之又少。下颌下腺是分泌功能旺盛的腺体，其功能的改变必然引起诸多器官、组织功能、形态的异常，继而造成患者生活上的困难。本实验选用SD大鼠建立D-半乳糖亚急性衰老模型，观察衰老大鼠下颌下腺谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)的改变及探讨细胞衰老与端粒酶活性的关系，为预防衰老奠定细胞学的基础。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 PCR仪(美国MJResearch公司)；DY892 1型电动匀浆机(宁波新芝科器研究所)；721W可见光分光光度计(中国上海)；LD5-2A 离心机、旋涡混匀器(中国北京)；细胞裂解试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；端粒酶活性检测TRA-ELISA试剂盒(Roche公司)；GSH-Px 试剂盒、T- AOC试剂盒(南京建成生物工程公司)。

1.2实验动物的选择及模型的建立 实验大鼠购自河北省实验动物中心(合格证编号：605106)，选用8周龄清洁级SD雌性大鼠10只，体重180～220 g，饲养温度(22±2)℃，自然光照，随机分为正常组和模型组，每组5只。正常组大鼠正常喂60 d。模型组大鼠称重后按0.5 ml·100 g-1·d-1(300 mg/kg)腹腔注射6% D-半乳糖，1次/d，连续 60 d。

1.3新鲜标本的取材方法 正常组及模型组大鼠末次给药后1 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，剪开颈部皮肤暴露出下颌下腺，分离并摘取下颌下腺，置液氮中保存备用。

1.4下颌下腺组织抗氧化能力的检测 下颌下腺组织冰浴中用Tris缓冲液制匀浆 -20℃冷冻保存。GSH-Px 活力检测：10%下颌下腺组织匀浆 0.2 ml 按试剂盒操作法测 OD 值。T-AOC的检测：取10%下颌下腺组织匀浆0.2 ml，按测试盒操作法加入试剂，37℃水浴中温育30 min，按测试盒操作法加入试剂，旋涡混匀器充分混匀，室温静置10 min，蒸馏水调零，1 cm光径比色杯，于520 nm处，测各管吸光度值。

1.5采用端粒重复扩增-微孔板杂交法检测下颌下腺细胞端粒酶活性

1.5.1组织的处理及端粒酶的提取 取40～100 mg(-70℃)冷冻下颌下腺组织用冰预冷的洗液洗1次，4℃，10 000 r/min离心1 min，沉淀加200 μl冷裂解液悬浮，冰浴25 min，4℃，16 000 r/min离心20 min，移取上清液，-70℃冰箱保存。

1.5.2检测端粒酶活性 使用端粒酶活性检测TRA-ELISA试剂盒(德国Roche公司)，按试剂说明书的操作步骤，进行端粒序列的复制、TRAP扩增、产物的固相与杂交及ELISA检测，于450 nm处测吸光度值，按公式计算端粒酶的相对活性。

1.6统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，计量资料组间比较行单因素方差分析。

2 结 果

2.1衰老模型的评价 模型组大鼠每天用电子天平测体重以确定用药剂量，同时观察大鼠毛色、行为等外观特征的改变。实验前，各组大鼠毛色白，有光泽，精神状态良好，行动正常。随着实验的进展，模型组大鼠出现毛色变黄、无光泽、脱毛严重、行为迟缓等衰老体征。

2.2各组大鼠下颌下腺组织抗氧化能力的检测结果 模型组GSH-Px、T-AOC表达最低(15.64±3.94、0.19±0.14)U/ml，正常组最高(92.74±3.74、2.04±0.17)U/ml，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3端粒酶活性检测结果 模型组端粒酶OD值(0.03±0.06)最低，正常组(0.28±0.51)最高(P<0.01)。

3 讨 论

衰老的自由基理论认为衰老过程中的退行性变化是由于人体在正常的新陈代谢或各种应急情况下产生的自由基的有害作用造成的。正常情况下，人体自由基的产生和清除处于动态平衡。自由基清除系统是生物体内的抗氧化保护系统。它们能够随时清除体内多余的自由基，保持自由基的平衡。但如果自由基产生过多或清除障碍时，动态平衡就被打破，导致组织器官的退行性改变和衰老的发生。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，能清除细胞内脂质过氧化产物(ROOH)和H2O2，保护细胞膜结构和功能免受过氧化氢的氧化损伤，因此GSH-Px活性的变化也可反映机体抗氧化能力的变化。本研究说明下颌下腺与其他组织一样，随衰老其氧化水平，抗氧化能力发生明显改变。

近年发现细胞衰老与细胞内染色体末端端粒长度密切相关，人类细胞端粒是其染色体末端一段TTAGGG重复序列，防止染色体DNA降解、末端融合、非正常重组和染色体的缺失。被称为细胞分裂的“定时钟”。Harley等〔4〕研究发现,体外培养的人类细胞每分裂一次，端粒即丢失若干个碱基对，这是由于端粒酶的表达减少所致，有活性的端粒酶对端粒长度的维持起着重要的作用。若端粒酶正常表达,端粒就不会缩短,细胞就不会衰老。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA组分含有端粒重复序列的模板(5′-CUAA CCCUAAC-3′)；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性。端粒酶能以自身RNA的模板区为模板，-逆转录复制合成染色体末端的端粒序列，来维持与染色体稳定至关重要的端粒结构〔5〕。人类端粒酶逆转录蛋白的成功重组显示端粒酶和端粒缩短与细胞衰老存在着密切的联系〔6〕。端粒酶具有促进端粒延伸作用，在没有端粒酶的细胞中，端粒会逐渐缩短直至染色体损伤；有端粒酶存在的细胞，端粒的长度能得以保持，使之处于一种不断伸缩的动态平衡中〔7〕。正常组织中，生殖细胞和部分造血干细胞呈弱端粒酶活性，胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活。如果在正常体细胞中重建端粒酶活性，就可维持细胞的端粒长度，延缓细胞的衰老〔8〕。

4 参考文献

1Printz C.Scientist honored for role in discovering telomerase〔J〕.Cancer，2010；116(6):1393-4.

2Calado RT，Young NS.Telomere diseases〔J〕.N Engl J Med,2009；361(24):2353-65.

3Song JS，Kim HP，Yoon WS,etal.Adenovirus-mediated suicide gene therapy using the human telomerase catalytic subunit ( hTERT) gene p romoter induced apoptosis of ovarian cancer cell line〔J〕.Biosci Biotechnol Biochem，2003；67(11):2344-50.

4Harley CB,Futcher AB,Greider CW.Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts〔J〕.Nature,1990；345(6274):458-60.

5Matsuo T,Shay JW,Wright WE,etal.Telomeremaintenance mechanisms in soft-tissue malignant fibrous histiocytomas〔J〕.J Bone Joint Surg Am,2009；91(4):928-37.

6Bodnar AG,Ouellette M,Frolkis M,etal.Extension of lifespan by introduction of telomerase into normal human cells〔J〕.Science,1998；279(16):349.

7张 婷，王晓民.端粒、端粒酶的发现和意义〔J〕.首都医科大学学报，2009；30(5):718-22.

8Granger MP，Wright WE，Shay JW.Telomerase in cancer and aging〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2002；41(1):29-40.