Aβ1～40、Aβ1～42与Aβ25～35在阿尔茨海默病模型复制中的评价

罗 磊 杜艳军 孙国杰

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

阿尔茨海默病(AD)患者大脑皮质弥散性萎缩，神经元丢失，突触减少，细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成老年斑(SP)和细胞内tau蛋白异常磷酸化导致神经原纤维缠结(NFT)形成是其特征性病理变化。因此，建立能够较好模拟AD患者行为学及组织病理学方面改变的动物模型是AD研究的重点之一,将有助于推动对AD 发病机制的研究及治疗药物的筛选。目前，在AD的模型复制中，大多集中在模拟AD主要病理特点之一，即SP的形成为主，多采用海马注射Aβ1～42、Aβ1～40与Aβ25～35淀粉样蛋白进行模型复制。在动物实验中，模型是评价实验结果的决定性依据，因此，能够建立合适的AD模型是实验研究的基础。本文对比Aβ1～42、Aβ1～40与Aβ25～35的来源、结构及与AD的特异性关系，分析三种模型各自的特点及其在模型复制中可能存在的差异性。

1 淀粉样前体蛋白(APP)与AD

APP分子量110～135 kD，该蛋白的基因定位于人类21号染色体长臂的中段,为一个选择性的夹板样半单螺旋形的跨膜蛋白,长的等位体包含有770个氨基酸,由2个外显子构成,可在大多数组织中表达。短的等位体含有695个氨基酸,主要在大脑组织中表达。基因转录后通过不同剪接方式可以产生6 个以上转录产物:APP770、APP751、APP714、APP695、APP563、APP365等,前四者是主要形式,且均携带有相当于Aβ的片段,后两者不携带Aβ；其中APP770、APP751的mRNA 中携带Kuitz型蛋白酶抑制剂的密码(KPI),其余四种产物不携带KPI〔1～3〕。

APP为一种含有多个功能区,以一次跨膜形式存在的Ⅳ型糖蛋白。它由大的N-末端胞外区域,跨膜区及小的C-末端胞浆区组成。而APP胞外区又是由几个独立的结构域组成,具有相对独立的功能〔4〕。与AD密切相关的就是APP的Aβ区，APP蛋白研究的焦点也主要集中在这个区域。大约有40种各种长度的Aβ多肽,在一种接近生理的条件下,可溶性Aβ40或Aβ42最可能的结构是由两个α螺旋组成,中间经过一个环连接。与这些可溶性Aβ相比,淀粉纤维中的Aβ主要是以β折叠的形式存在。从α螺旋到β折叠的形态转换可能是Aβ形成淀粉纤维的一个结构基础。如Duch和Arctic突变,发生在Aβ的α螺旋区,使α螺旋结构不稳定,从而转变成β折叠的形态〔5〕。同时，体内淀粉样纤维的形成不仅仅与Aβ浓度或(和)Aβ42/40比例的升高有关而且与其他的因素,如金属离子、糖基氨基甘氨酸和其他的细胞外基质有关。研究表明〔6〕,Aβ不仅是一个生理损耗过程的副产品,被认为能调节离子通道的功能并且对神经元正常运作起一定的作用。而一些早期的研究认为低浓度可溶性的状态具有促生长作用〔7〕。但Kamenetz等〔8〕发现，从神经元分泌的Aβ能够对突触的活动有反应,Aβ能以负反馈的形式下调突触传递。

2 Aβ与AD

目前，“Aβ假说”是AD发病的主要机制之一，已被广泛接受，并且认为Aβ聚集是AD发病过程中的关键机制，Aβ在特定脑区的聚集沉积是AD患者主要的病理变化，现已证实其神经毒性，造成突触损伤，神经元死亡，导致AD的发生〔9〕。曾经存在两种不同观点,一种观点认为Aβ沉淀可引起患者神经组织退化；另一种观点则认为Aβ沉淀形成老年斑仅仅为神经细胞损伤导致的结果,而不是发病的先决条件〔10〕。

Aβ是从APP的第672到711位残基间裂解产生的片段。包含了Aβ的细胞外区的最后28个残基及跨膜区的14个残基(分别由16、17外显子编码)。正常情况下APP主要是由α-分泌酶与γ-分泌酶共同切割,产生非致病性的片段P3,不会形成Aβ。而当编码APP的基因发生突变或其他原因导致β-分泌酶活性异常增高时,APP则容易被β-分泌酶与γ-分泌酶共同切割产生Aβ，主要包括Aβ40和(或)Aβ42两种分子,由39～43个氨基酸组成。Aβ42较Aβ40疏水性强,更易聚集,更容易导致AD SP形成〔11〕。其神经毒性作用主要与氧自由基代谢、与细胞内钙稳态紊乱、细胞凋亡等有关〔12〕。

3 模型评价

目前AD模型复制方法有损伤性动物模型、Aβ诱发AD动物模型、三氯化铝动物模型、复合型动物模型、炎症免疫动物模型、自然衰老动物模型、快速老化小鼠(SAM)动物模型、转基因动物模型等〔13，14〕。通过海马注射Aβ淀粉蛋白在AD模型复制方法中较为常用，注射药物大多集中在Aβ1～42、Aβ1～40与Aβ25～35之间。因此，探讨Aβ三种淀粉蛋白在模型复制中的差异及其与AD的特异性，具有一定的现实意义。

综上，虽然Aβ1～42、Aβ1～40与Aβ25～35均来源于APP，但是它们各自的结构及与AD的特异性关系各不相同。其中Aβ40是脑质膜和脑脊液中的正常可溶性产物,然而由于Aβ42具有疏水性，因此认为Aβ42是淀粉样斑块成核过程中的关键因素。研究〔15〕发现，Aβ42在AD的发病早期发挥着重要作用，这与其扩散性的斑块紧密联系；也有报道〔15〕认为，Aβ42较Aβ40疏水性强,更易聚集,认为Aβ42是斑块的核心蛋白，虽然Aβ40和Aβ42仅存在两个氨基酸的差异,然而它们之间具有显著的差异，通过电镜观察这两种蛋白的纤维形成过程，可见在溶液中Aβ42更倾向于形成斑块状沉积,而Aβ40则易形成典型的纤维结构，可能与Aβ42的相对更为紧密的二级构象有关，静电作用可能在Aβ42早期的聚集过程中起着重要的作用〔15〕。同时在AD的治疗过程中，有研究发现〔16〕，通过Aβ42免疫APP转基因小鼠可以有效预防淀粉样斑块、营养不良性神经突及胶质化的发展。可见，Aβ42不仅可以用于模拟AD，而且对抗Aβ42的方法同样具有预防AD发展的作用；王建秀等〔17〕通过原子力显微镜观察发现，Aβ25～35、Aβ42采用传统方法孵育7 d 后,原纤维聚集量很多,未见Aβ单体或寡聚体，而且Aβ42呈螺旋状态,纤维结构规整；Aβ25～35纤维结构较Aβ42短,未见典型的螺旋状态；Aβ42寡聚体制备过程中观察到经六氟丙醇(HFIP)作用后Aβ42均以单体形式存在。Aβ42与二甲基亚砜(DMSO)共同孵育24 h原子力显微镜成像可见高约3.0 nm 的寡聚体；48 h后可见较多寡聚体,室温作用72 h时寡聚体浓度较24 h时下降,而原纤维变长,生成更多分支。可见室温较4℃条件更有利于Aβ1～42纤维结构聚集。

综上，Aβ1～42最佳注射使用时间是在室温作用下72 h，源于其在72 h后原纤维可以变长，且有多种分支，更有利于沉淀，造成SP形成。虽然Aβ1～42与Aβ1～40均是针对AD的主要病理特点之一进行的模型复制方法，从淀粉样斑块的沉积与预防方面，Aβ42效果较为优于Aβ40；在实验动物选择方面，有报道〔18〕发现，人的Aβ具有Aβ1～42,Aβ1～40等多种类型,其中以Aβ1～42最重要,而老年恒河猴AD脑中以Aβ1～40为主。因此，在动物选择方面，Aβ42的选择更倾向于锯齿类动物如大鼠的模型复制；Aβ40的选择更倾向于灵长类动物如恒河猴的模型复制；Aβ25～35与Aβ1～42所致的病理特点虽然不同，但是它们均可成功复制AD模型，因此可以根据所需研究的刺激因素与研究目的的不同而选用相对特异性较强的模型复制方法，至于刺激因素和研究目的与模型的选取之间的特异性研究尚需进一步探讨；Aβ25～35与Aβ1～42在相同条件下聚集状态不同，Aβ25～35不仅比Aβ1～42纤维较短，而且其未形成典型的螺旋状态，这些均可影响Aβ25～35纤维的聚集。虽然Aβ1～42、Aβ1～40和Aβ25～35均是针对AD的典型病理特点之一，且是常用的模型复制方法。但模型复制成功的关键点在于Aβ纤维聚集，即SP形成，而Aβ25～35显然没有Aβ1～42更能促进SP形成，至于二者之间的差距需进一步研究；从淀粉样斑块的沉积与预防方面，Aβ1～40的疏水性也不及Aβ1～42，因此可以认为Aβ42更能模拟AD的发展过程，但是在动物选择上要加以区分，至于其差异性需进一步研究。

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