大鼠脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡相关调控因子的研究进展

林海平 王 永 沈 燕 王 舒

(天津中医药大学研究生院，天津 300073)

脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指脑缺血一定时间再恢复血液供应后，大脑功能不仅没有得到及时恢复，反而出现更加严重的功能活动障碍。缺血再灌注损伤是一种常见、复杂的病理生理过程，其主要的损伤形式是细胞凋亡(apoptosis)。细胞凋亡是指在一定的生理和病理条件下，机体为了维护内外环境的稳定，通过多基因的调控使细胞主动死亡的过程，属于一种生理性的细胞死亡。

近年来国内外的很多学者从多种角度研究脑缺血再灌注后的细胞凋亡机制，发现多种因素参与细胞凋亡。目前研究认为细胞凋亡主要存在两种途径：细胞外的死亡受体途径和细胞内的线粒体途径。在缺血性脑血管病中，神经元的细胞凋亡与坏死一样，对神经元的功能损害具有重要作用〔1〕。细胞凋亡主要发生在缺血程度较轻的半暗影区，是一种涉及多因素调控的复杂的主动死亡过程，其中主要包括：Caspase-3、NF-κB、Bcl-2/Bax等因子的调控。

1 Caspase-3与细胞凋亡

1.1Caspase家族 Caspase家族是一大类凋亡调控因子，最初有学者发现线虫属动物的细胞凋亡需要一种名为CED-3的蛋白，这种蛋白和哺乳动物白细胞介素-1转换酶(ICE)是同源物，因它们均特异性地在P1位点的天冬氨酸残基后切割底物，所以命名为Caspase。按其分子结构可将Caspase家族分为3大类：I类是ICE亚家族，作用于四肽序列WEHD，主要包括Caspase-1、4、5、11和13；Ⅱ类是CPP32亚家族，最易识别DEXD序列，包括Caspase-2、3、7和10；Ⅲ类是ICE-1亚家族，作用于EXD序列，包括Caspase-6、8和9；其后两类在细胞凋亡中起重要作用〔2，3〕。

1.2Caspase-3的激活及对细胞凋亡的作用 在Caspase家族中，Caspase-3是Caspase级联“瀑布下游”最关键的凋亡执行蛋白酶,其在正常细胞(包括神经细胞)中以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后激活，参与脑缺血再灌注后神经元损伤的病理过程，引起细胞凋亡。研究证明Caspase-3在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用〔4〕，是细胞凋亡的重要执行者和哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，被称作是“杀手蛋白”。

研究表明Caspase-3主要通过细胞凋亡的线粒体通路、死亡受体通路和内质网应激通路来介导细胞凋亡〔5～7〕。(1)线粒体通路：当缺血再灌注造成线粒体损伤后，细胞色素C(Cyt-C)作为应激传感器从线粒体中被诱导释放到胞质中，在ATP/dATP存在的情况下，Cyt -c能与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)结合，使Apaf-1构象发生改变继而寡聚化，接着和procaspase-9 结合形成“凋亡体”，从而激活Caspase-9，活化的Caspase-9又进一步激活下游的Caspase-3等，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡〔8〕。(2)死亡受体通路：肿瘤坏死因子超家族的死亡配体TNF-α和细胞表面的死亡受体FasL/CD95L相结合，使受体三聚化，然后通过DD(death domain)域募集衔接蛋白(如FADD)，衔接蛋白通过死亡效应域(DED)与procaspase-8 形成一个超分子复合物(死亡诱导信号复合物)，然后激活Caspase-8，进而启动Caspase级联反应，激活下游的Caspase-3等，引起细胞凋亡。(3)内质网应激通路：内质网中由于钙平衡的破坏和自由基蓄积引起其压力的改变，诱导Caspase-12(位于内质网膜)的表达，进而激活下游的Caspase-3，引起细胞凋亡。关于Caspase-3与脑缺血再灌注后细胞凋亡的具体作用机制，多数学者认为，激活后的Caspase-3可裂解细胞内相关酶类,破坏细胞骨架和核骨架，改变细胞形态，介导细胞凋亡。

近年来国内外很多学者都通过实验证实：大鼠脑缺血再灌注后Caspase-3表达明显增强，凋亡细胞明显增加，二者之间存在明显的时空相关性〔9，10〕；而通过向大鼠脑室内注射Caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk后，发现梗死区细胞凋亡的数量明显减少〔11〕。这些研究均证明了脑缺血再灌注后Caspase-3的表达及其与脑缺血损伤的密切关系：在脑缺再灌注损伤的Caspase级联反应中，Caspase-3作为下游凋亡效应因子起着关键性作用。

2 核转录因子-κB(NF-κB)与细胞凋亡

2.1NF-κB NF-κB首先是由Rwiansen在1986年发现的。他在成熟B细胞和浆细胞中发现一种新的蛋白，能与免疫球蛋白κ轻链内含增强子的特异性序列结合，该序列由10个核苷酸组成(5-GGGACTTTCC-3)，故命名为κB，是一种广泛存在于神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞中的核转录因子〔12〕。其家族成员在氨基末端部位均含有一段大约300个氨基酸所组成的保守区，被称为Rel同源结构域，包含有DNA结合区、二聚体形成区、核定位信号(NLS)、前激肽释放酶激活剂(PKA)磷酸化区域。根据C-末端的不同，可以将NF-κB家族成员分为两组：第一组包括P50和P52，分别由其蛋白前体P105和Pl00裂解而来；第二组包括没有前体的P65/RelA 、RelB 和c-Rel，其中发挥主要生理功能的是由P50-P65所形成的异源二聚体，即我们通常所指的NF-κB。

2.2NF-κB的激活及对细胞凋亡的作用 在静息状态下，NF-κB家族形成的二聚体与IκB-α(NF-κB的抑制蛋白)以三聚体的形式存在于胞质中，此时的NF-κB不具有调节基因转录的能力〔13〕，当受到激活的蛋白激酶刺激时，IκB-α发生磷酸化,磷酸化后的IκB-α使NF-κB游离于胞浆中，迅速发生核移位，诱导白细胞介素-1、细胞间黏附分子、肿瘤坏死因子-α等的表达和钙超载、氧自由基的形成，参与细胞凋亡的调控〔14，15〕，这是NF-κB主要激活途径。此外，酪蛋白激酶2(CK2) 激活后引起IκB-α的C端磷酸化，从而使NF-κB的激活不依赖IκB，而是通过p38丝裂原活化蛋白激酶，因此p38-CK2-IκB-α也是激活NF-κB的途径之一〔16〕。

NF-κB对细胞凋亡的作用机制主要体现在通过调控一系列凋亡相关因子的表达来实现的。有研究认为脑缺血再灌注可导致细胞内钙超载、氧自由基形成等，激活内质网应激反应，进而激活NF-κB，活化后的NF-κB则诱导凋亡基因(如TRAIL-1和TRAIL-2 死亡受体)表达上调，最终导致细胞凋亡〔17〕；而NF-κB的活化还可以通过诱导细胞内凋亡抑制蛋白c-IAP1和c-IAP2的表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，抑制线粒体通透性转换孔的开放，进而阻止Caspase-3，7，9的活化而抑制细胞凋亡。NF-κB还可以通过对其自我吞噬作用的抑制来发挥抗凋亡作用〔18〕。Nijboer等〔19〕则认为NF-κB在细胞凋亡中起双重作用，早期NF-κB的激活加重脑损伤，而NF-κB的持续激活则能产生内源性神经保护因子，上调抗凋亡因子的表达，抑制细胞凋亡。Crack等〔20〕认为NF-κB对细胞凋亡起促进还是抑制作用主要和NF-κB的产生部位、刺激信号、产生量以及持续时间有关。

NF-κB在细胞凋亡中究竟起何种作用，目前还没有定论。Peter等〔21〕在实验中发现脑缺血再灌注后，与野生型老鼠比较，抗氧化剂Gpx1敲除鼠的NF-κB表达含量显著增加，脑缺血损伤范围明显扩大，大脑皮层和纹状体区域的神经细胞凋亡数量也相应增加，由此推断脑缺血再灌注后脑区的超氧化状态引起NF-κB的过表达，促进细胞凋亡。通过抑制IκB-α的降解及磷酸化可以显著降低NF-κB的活性，从而减轻缺血再灌注所引起的脑组织损伤〔22〕；而Hill等〔23〕在大鼠脑缺血再灌注损伤实验中发现NF-κB对细胞凋亡起抑制作用。因此NF-κB对细胞凋亡的具体作用还有待进一步的研究。

3 Bcl-2/Bax与细胞凋亡

3.1Bcl-2家族蛋白 Bcl-2作为目前首个被确认有抑制细胞凋亡作用的因子〔24〕，近些年成为脑缺血再灌注损伤的研究热点之一，其家族成员之间的相互作用对脑缺血再灌注后神经细胞的凋亡起了重要的调节作用。

按其结构和对细胞凋亡的不同作用可将Bcl-2家族分为两大类：一类为抗凋亡蛋白，主要包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；另一类为促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak、Bid等。其中Bcl-2和Bax作为Bcl-2家族蛋白的最主要成员，其表达的变化对细胞凋亡起重要的调节作用〔25〕。Bcl-2由239个氨基酸组成，主要位于线粒体膜、内质网和核膜等处，Bax是一种跨膜蛋白，主要存在于细胞内膜、细胞质和细胞核中，与Bcl-2抑制细胞凋亡的作用正好相反，Bax作为Bcl-2家族中最重要的促细胞凋亡因子，能与Bcl-2形成异源二聚体，从而促进细胞凋亡。

3.2Bcl-2/Bax的激活及对细胞凋亡的作用 Bcl-2和Bax作为一组重要的细胞凋亡调节因子，二者在正常状态下构成一个平衡体系。当细胞受到各种刺激因素作用后，他们的表达就会发生变化，二者的比值决定了细胞是否凋亡：当Bcl-2表达占优时抑制细胞凋亡，Bax表达占优时则促进细胞凋亡〔26〕。当受到凋亡刺激时，Bcl-2与其他家族成员如Bax等通过磷酸化、蛋白水解等方式，最终定位于线粒体膜，通过调节膜的通透性〔27〕，使得Bcl-2能在线粒体膜上通过多种途径抑制细胞凋亡：(1)Bcl-2蛋白作为线粒体PT孔道的有效组成成分，其高表达后可以阻止Cyt-c等穿过线粒体膜，进而阻止由Cyt-c所引起的凋亡程序(Caspase级联反应)〔28〕，抑制细胞凋亡。(2)Bcl-2高表达后可以阻止bax/bak的寡聚化，从而抑制Cyt-c和AIF(凋亡介导因子)等重要蛋白的释放，使细胞免于凋亡〔29〕。(3)Bcl-2还可以调节线粒体巯基的氧化还原状态，控制其膜电位，阻断氧化作用对细胞的破坏，改变钙离子分布，从而激活内源性内切酶，抑制谷胱甘肽(GSH)的外移以降低胞内的氧化还原电位，进而抑制细胞凋亡。此外，Bcl-2还可以将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不能发挥凋亡作用从而保护细胞。而 Bax当受到凋亡刺激后，由胞质向线粒体外膜转位，与膜上的电压依赖性离子通道结合， 拮抗Bcl-2对线粒体通透性的抑制作用，从而开放线粒体通透转换孔(MPT)，最终启动Caspase相关的凋亡级联反应，促进细胞凋亡〔30〕。综上所述，Bcl-2/Bax主要通过调节线粒体膜的通透性来调节细胞凋亡，二者通过在线粒体外膜形成离子通道，阻止或促进细胞色素C的释放，进而调节一系列凋亡因子，完成对细胞凋亡的调节。Hetz〔31〕通过研究发现，脑缺血再灌注后，Bcl-2和Bax之间的平衡状态被打破，二者表达的比率决定了脑缺血再灌注后细胞凋亡与否：当Bcl-2过表达时抑制细胞凋亡，相反则促进细胞凋亡，并且还发现通过抑制Bax通道活性可以降低缺血再灌注后的细胞凋亡。近期国内外研究同样证实了Bcl-2和Bax对细胞凋亡的调节作用，与之前的大量研究结果相似：Bcl-2对于脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的抑制作用十分明显，其与Bax之间的相互作用以及二者之间表达比值的变化共同决定细胞凋亡与否〔32，33〕。

4 结 语

脑缺血再灌注损伤是一种机制复杂而又临床常见的病理生理过程，细胞凋亡是其严重的损伤形式之一。有学者认为细胞凋亡是涉及多种凋亡相关因子共同表达的结果，同时又受到多种内外因素的调节，如细胞内钙失稳态、能量代谢障碍、炎性反应、兴奋性氨基酸释放增加、氧自由基的生成等〔34〕。

长期的研究发现Caspase-3、NF-κB、Bcl-2 /Bax等多种凋亡调控因子均参与了脑缺血再灌注后细胞凋亡的发生，这些因子分别作用于不同的环节,对神经细胞的凋亡起调控作用。此外，在脑缺血再灌注损伤中这些凋亡调控因子并不是单独表达的，它们之间通过相互作用，共同构成一个复杂的网络体系调控细胞凋亡的发生。如Caspase-3作为Bcl-2的生理性半胱氨酸蛋白酶，对Bcl-2蛋白具有重要的酶解修饰作用，在细胞发生凋亡时，通过酶切Bcl-2蛋白来抑制Bcl-2的抗凋亡作用；另一方面，Bcl-2作为Caspase-3的上游调控因子，其过度表达可以有效抑制各种因素诱导的Caspase-3激活和由此产生的细胞凋亡〔35〕。Bax可以诱导Cyt-c的释放，通过细胞凋亡的线粒体通路激活Caspase-3蛋白酶，引起细胞凋亡；同时又可以诱导Bcl-2等抗凋亡相关基因的表达下调〔36〕，加速细胞凋亡。NF-κB激活后可以通过相关途径上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，阻止Caspase-3等的活化而抑制细胞凋亡。总之，这些凋亡调控因子通过相互作用来共同完成对细胞凋亡的调控，而不仅仅是在各自凋亡通路上单独发挥作用。因此，对这些细胞凋亡调控因子的深入研究，尤其是将其作为一个整体来综合研究，将有利于我们进一步探索脑缺血再灌注损伤的机制，为临床上脑血管病的预防及治疗提供新的科学依据。

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