动脉粥样硬化脑缺血／再灌注动物模型的研究进展

范晓迪，刘建勋，林成仁

（中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京 100091）

脑卒中（stroke）是由于急性脑循环障碍所致的局限或全面性脑功能缺损综合征，是目前导致人类死亡与残疾的三大主要疾病之一。脑卒中包括缺血性和出血性两大类，其中缺血性脑卒中（ischemic stroke），又称脑梗死（cerebral infarct），是脑血管疾病（cerebrovascular disease，CVD）的最常见类型，可占70%。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是诱发心脑血管疾病的主要病理基础。

目前国内外关于动脉粥样硬化脑缺血／再灌注模型研究的报道较少，一般多采用大鼠制备脑缺血模型，其主要原因在于大鼠脑血管解剖结构，神经元接近高等动物，重现性好且廉价，但单因素模型未能较确切地模拟人类在动脉病变致慢性缺血性损害基础上发生的急性脑卒中。为了系统地研究脑缺血的病理生理及观察药物的治疗作用，必须有一个较接近临床的，重现性好，可控的脑缺血动物模型。由于动脉粥样硬化脑缺血／再灌注模型更加符合人类的病理生理过程，因此现将国内外关于此类报道综述如下。

1 实验动物的选择

制备AS动物模型常用的动物有兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、鹌鹑、狗、猪和非人类灵长类动物等，每种动物都有其各自的优缺点，依据实验的研究目的不同可以选择适合的动物建立模型。近些年，国外制备AS动物模型主要应用基因敲除小鼠（ApoE KO／LDLr KO）；国内主要以兔和大鼠研究居多。对于制备脑缺血模型国内外均主要选用啮齿类动物（如小鼠、大鼠、沙土鼠）进行实验研究。

2 动物模型的制作方法

2.1 高脂喂养法 高脂血症是动脉粥样硬化发生的一个危险因素，大量的动物实验已证明富含胆固醇的饲料可以导致AS，粥样斑块可以导致血管壁狭窄，尤其是心脑等重要器官的动脉管壁发生狭窄或阻塞时，致使心脑等重要器官短暂缺血或梗死。Suzuki［1］选用3只杂种狗，采用高脂饮食喂养建立脑动脉粥样硬化模型，分别在喂养48个月（n＝2）和55个月（n＝1）后，取组织观察发现：颅内动脉内膜破坏和增生变厚，管腔狭窄；脂质病灶处可见内吞脂质的巨噬细胞、胆固醇结晶和肌内膜细胞，同时可见成纤维细胞和平滑肌细胞等病理改变。该方法病理过程与人类自然发病过程相似，但是模型制备耗时过长，且缺血部位及程度不容易控制。

2.2 高脂加手术法

2.2.1 高脂加结扎（或夹闭）两侧颈总动脉（2-vessel occlusion，2VO）法 阻断双侧颈总动脉法可作为慢性脑缺血的模型之一，该模型可引起组织病理学损伤和空间学习能力障碍，在人体这种学习能力下降可能与海马锥体神经元损伤和死亡有关［2］。王海涛等［3］选用♂ Wistar大鼠给予高脂饲料喂养造成动脉粥样硬化模型，36周后实施微动脉夹夹闭两侧颈总动脉造成脑缺血，45 min后再通，术后大鼠正常饲养3 d，对实验动物主动脉及脑组织进行Masson和HE染色，观察发现主动脉动脉壁内膜明显增厚，部分内皮细胞脱落；脑组织大脑皮层神经元细胞核固缩，核染色质深染，核呈梭形或三角形，周边出现较大空晕，脑皮层有灶性出血伴灶性淋巴细胞浸润，毛细血管萎缩，血管周围出现较大的腔隙，海马回区神经元细胞核固缩，染色质深染。由于大鼠Willis环的脑血管结构，该方法梗死灶不明显且部位不确定，无法行TTC染色观察梗死灶及计算梗死体积，模型稳定性、重复性较差。

2.2.2 高脂加大脑中动脉栓塞／再灌注法（middle cerebral artery occlusion／reperfusion，MCAO／R） 线栓法阻断大脑中动脉，造成大脑中动脉供应区血流中断，导致局灶性脑缺血，由于该方法不需要开颅，避免了手术对脑组织的创伤和刺激作用；可以准确控制缺血及再灌注时间；且具有稳定性强、重复性高的特点，是目前最为常用的局灶性脑部缺血模型。张克俭等［4］选用♂Wistar大鼠一次性腹腔注射维生素D3（60万IU·kg－1），与高脂饮食诱导相结合建立AS大鼠模型，持续喂食6周后，实施尼龙栓塞法建立MCAO，阻断1 h后实现再灌注。张小菊等［5］采用HE染色观察脑组织的病理形态及免疫组化法检测脑组织中MMP-9、COX-2的表达，高脂脑缺血组和非高脂脑缺血组的大鼠脑切片可见梗死部位苍白，梗死中心区神经元减少、胞核固缩、胞质淡染，神经细胞明显减少，有变性坏死的细胞溶解消失后残留的轮廓等细胞坏死表现；缺血中心区结构疏松，间质水肿；梗死周边神经元及部分胶质细胞肿胀、空泡变性及胞质淡染，小血管扩张充血，周围少量炎症细胞浸润，高脂脑缺血组较非高脂脑缺血组脑组织损伤程度加重且脑组织中MMP-9、COX-2阳性细胞表达增加。

2.2.3 高脂加主动脉弓选择性动脉结扎法 Zhang等［6－7］选用♂新西兰大白兔给予高脂饮食喂养，持续喂养12周，按照结扎靶血管的不同分别实施单纯闭塞右侧锁骨下动脉椎动脉开口近端、单纯闭塞右侧头臂干左侧颈总动脉开口远端和同时闭塞上述两个部位，1周后在全身麻醉下应用Prowler-10微导管配合SilverSpeed-10微导丝在4F造影管的导引下行主动脉弓和靶血管选择性动脉造影，确认靶血管结扎是否成功以及结扎后血流动力学改变情况。主动脉弓及颈总动脉分叉处经病理HE染色可见动脉内膜明显增厚甚至凸向管腔，内皮排列不规整，中膜平滑肌迁移，斑块内可见泡沫样细胞和胆固醇结晶，该研究建立了不同强度的血液动力性低灌注模型，尤其适用于研究AS时血液动力性脑缺血状态下侧支循环形成的发达程度与相关机制，为研究AS血管重塑提供了很好的动物模型。

2.3 高脂加药物法 高脂加内皮素-1（endothelin-1，ET-1）注射法：朱磊等［8］选用♂ SD大鼠一次性腹腔注射维生素D3（60万IU·kg－1）与高脂饲料诱导相结合建立AS大鼠模型，持续喂养64d，在正常组、AS组中随机抽取3只大鼠，水合氯醛麻醉后沿主动脉瓣至髂动脉分支处剥离全长动脉，进行主动脉HE染色病理结果提示：AS组管腔内膜、中膜和外膜分界不清楚，管壁厚薄不一，管腔面部分内皮细胞脱落，局部内皮细胞聚集成小团块，管腔内见大的血栓形成，血栓内见钙盐沉积；在d 65参考顾国军等［9］方法以内皮素-1注射法复制急性脑缺血模型，顾国军等采用该方法对脑组织冠状切片，TTC染色显示ET-1组梗死灶体积为（23.14±2.3）%，经HE染色发现ET-1组脑组织缺血区染色浅，缺血区与正常组织分界较清楚，形成梗死灶，梗死灶内可见明显的组织结构疏松，神经纤维网空泡化且大量神经元丢失。梅和珊等［10］在对ET-1诱导的大鼠局灶性脑缺血／再灌注模型研究中发现该模型操作简单，造成的脑梗死范围稳定、重现性好，是一种更接近人类卒中具体情况的较理想的局灶性脑缺血／再灌注模型。

2.4 基因敲除小鼠 基因敲除小鼠加大脑中动脉栓塞／再灌注法（MCAO／R）：随着基因工程技术在AS动物模型中的应用，近年来，基因工程小鼠被大规模使用。基因工程小鼠是采用基因工程技术将编码某一特定蛋白质的特殊等位基因缺失。最广泛采用的基因工程小鼠AS模型是载脂蛋白E（ApoE）和低密度脂蛋白受体（LDLR）基因缺陷小鼠。在此基础上建立小鼠 MCAO，实验基础可靠。Kim等［11］，Lu等［12］，Mogi等［13］，Iwai等［14］，曹阳等［15］均采用 ApoE KO小鼠高胆固醇饲喂10周后，再实施MCAO／R法建立小鼠动脉粥样硬化脑缺血／再灌注损伤模型。Kim等［11］实验研究发现喂饲高脂的ApoE KO小鼠和普通饲料的ApoE KO小鼠主动脉经 Oil red染色，动脉粥样硬化性损伤面积，分别是（19.41±2.81）mm2、（4.11±0.83）mm2（P＜0.01）；脑组织切片经TTC染色梗死体积分别是（101.75±12.06）mm3、（57.73±15.82）mm3（P＜0.05）；AS脑缺血组eNOS-和脂联素－阳性细胞数量较脑缺血组表达明显减少。

3 模型的评价方法与指标

目前，动脉粥样硬化脑缺血／再灌注动物模型无统一的评价指标，且以AS复合脑缺血动物模型的基础实验报道较少，现将相关实验报道中的评价方法及病理生理指标进行总结分析，以便更好的了解该复合动物模型的病理生理特点，为以后的模型评价、发病机制、药物治疗作用等实验研究提供参考与依据。

3.1 行为学评分法 神经功能损伤评分是诊断和疗效评价的重要指标，国际脑卒中治疗临床前研究指南（STAIR）指出，在脑缺血药物研究中，多重指标综合评价的重要性，其中包括行为学评价。目前对大鼠局灶性脑缺血模型的神经功能评分多采用 Bederson等［16］及 Garcia等［17］评分标准，有学者对其进行相关性分析发现［18］，Garcia评分较Bederson评分，与脑梗死病灶有更高的相关度，说明Garcia评分可能有利于更全面反映动物神经功能的损伤程度。有文献报道，对小鼠局灶性脑缺血模型的神经功能评分［20］可采用Clark［19］评分标准。在临床神经功能损伤评分中，往往要求对整体意识水平、感觉、视觉、运动、共济等方面进行综合评价，目前评定脑缺血动物功能和行为往往偏于运动功能［4，11，15］，而忽视了感觉功能等。Bederson评分的局限性即体现在此；Garcia和Clark评分对神经功能则进行了较全面的评价，评价指标相对固定和客观，主观因素的偏倚影响较小，且可操作性好。在局灶性脑缺血神经功能评价时，我们应尽量选择Garcia或Clark评分标准。

3．2 TTC染色测定脑梗死面积 TTC染色法对测定脑梗死面积具有直观性，肉眼即可辨认脑梗死灶及脑梗死程度，同时采用图像分析软件可计算出脑梗死的面积，是目前实验研究急性脑缺血的重要观察指标之一。Kim等［11］，Iwai等［14］，Hatcher等［21］等在实验中研究发现 AS MCAO组较MCAO组脑梗死面积明显增大。在AS脑缺血模型中评价该指标，仍然具有重要的作用。

3.3 组织病理学检测 病理形态学变化的观察是确定模型病变的性质、程度和评价药物效应的重要部分。目前多采用HE染色法观察实验动物主动脉根部和其他不同病变部位或脑组织梗死边缘区组织病理学改变，并利用显微镜或透射电镜技术观察主动脉病变或脑组织梗死边缘区细胞超微结构的改变；TUNEL凋亡法可检测分析脑缺血半暗带和梗死灶中心区凋亡阳性细胞的数目。

3.4 影像学研究 影像学技术是脑卒中诊断与治疗不可缺少的检查手段，其中数字减影血管造影（DSA）、颈动脉及经颅彩色多普勒超声、CT血管造影（CTA）、头部核磁共振血管成像（MRA）等技术被广泛地应用于临床，对脑梗死的预防及治疗决策起到了至关重要的作用。目前，在检测脑缺血动物模型成功与否或观察药物对脑血流是否有影响多采用激光多普勒血流监测仪（LDF）、激光扫描多普勒血流监测，以及激光散斑衬比度成像（LSCI）等技术，LSCI较其他两种技术具有高时空分辨率，且无创、非接触、无需扫描等优势。Ayata等［22］采用了激光散斑衬比成像技术监测ApoE KO脑缺血小鼠脑血流变化，观察高脂血症对脑血管反应的破坏及缺血／再灌注的损伤情况。

临床上常用的主要成像技术虽然可对动物进行活体成像，但由于分辨率受限，只能观察到位于脑部浅表的直径较大的血管，无法对位于深层微小血管结构的变化进行观察或评估。有文献报道，同步辐射成像技术和Micro-CT成像技术可以解决上述问题，该技术可观察到直径100μm以下的血管，具有很高的空间分辨率，为研究脑部的微血管变化提供了一种先进的手段。管永靖等［23］利用该技术建立了有效、直观的活体大鼠脑微血管高分辨率动态成像体系，为有效进行活体动物脑部微血管结构观察提供了新方法新途径。该技术的发展无疑对小动物活体成像提供了新的思路和新的方法，也为新动物模型的建立及现有动物模型的稳定性、可控性评价提供了有力的证据。

3.5 脑水肿的测定 根据实验要求，缺血或缺血／再灌注一定时间后，即刻断头取脑，分别称取脑湿重和干重。脑水肿也可以间接以血脑屏障（blood-brain-barrier，BBB）破坏的程度来表示。BBB是位于脑血管与脑组织间的一个复杂结构，主要由脑毛细管内皮细胞及其间的紧密连接、基膜和周细胞、星形胶质细胞终足形成的胶质膜和细胞外基质组成。伊文斯蓝（EB）和荧光素钠（NF）可以用于测定BBB的损伤。正常情况下，EB和NF不能通过BBB，但颅脑损伤后，BBB完整性受到破坏，EB和NF即可进入脑组织间隙，采用分光光度计法和荧光法检测它们进入脑组织的含量，可定量评价BBB的破坏程度。近年来，研究发现有诸多因子参与了脑缺血后BBB破坏，如基质金属蛋白酶（MMPs）、紧密连接结构（TJ）、水通道蛋白（AQP）、细胞因子（如 TNF-α、IL）、黏附分子（ICAM）、血管内皮生长因子（VEGF）、纤溶酶原激活物（tPA）等，通过对这些蛋白及因子的检测可以了解BBB的破坏程度［24］。

3.6 实验指标检测

3.6.1 血脂指标 血脂异常是目前公认的导致AS的重要危险因素，血脂指标是检测AS模型是否成立的重要指标之一。实验研究显示［3］，与脑缺血组相比，AS和AS脑缺血组大鼠的血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）明显升高（P＜0.01）；高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）明显降低（P＜0.01）。由于高脂血症、AS等疾病均可导致血脂的异常改变，血脂指标并不能作为AS脑缺血／再灌注复合模型的特异性指标。

3.6.2 氧化应激 通过检测一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、尿激酶型纤溶酶原激活因子（u-PA）等指标发现动脉粥样硬化病变可加重脑缺血／再灌注的损伤，即在AS复合脑缺血／再灌注模型对脑组织的损害程度较单纯急性脑缺血／再灌注严重。王海涛等［25］采用Lowry法测定结果显示：与脑缺血模型组、AS组比较，AS脑缺血模型组大鼠的脑组织NO含量和NOS活力明显升高（P＜0.05）；SOD、GSH-Px活性均下降，差异有显著性（P＜0.01）；而MDA含量明显升高（P＜0.01）。张克俭等［4］采用SABC免疫组化法检测发现，MCAO／R后12 h，AS脑缺血组较单纯脑缺血组PAI-1在病灶周边神经元、胶质细胞、微血管内皮细胞表达增强，而u-PA在胶质细胞、微血管内皮细胞、基底组织表达减弱，随时间延长至24 h时表达更加明显。

3.6.3 炎症因子 炎性细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和效应，通过炎症介质调控推动粥样斑块病变的程度和斑块结构的改变，主要参与的炎症因子有单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、细胞因子（如 TNF-α、IL）、黏附分子（ICAM）、C-反应蛋白（CRP）。MCP-1的活性是白细胞渗透能力增强的关键步骤；CRP作为体内非特异性炎症标志物，是急性炎症反应的最显著的灵敏性指标；张振强等［26］用酶联免疫法在复合脑缺血组与单纯脑缺血组组间比较血清中MCP-1、TNF-α和CRP含量，实验结果显示，MCP-1、TNF-α在复合脑缺血组在缺血3、7 d血清含量均增多，差异有显著性（P＜0.05）；CRP在复合脑缺血组织3 d血清含量增多（P＜0.05）。

3.6.4 VEGF、PDGF-BB、vWF、TM、HIF-1α 研究证实，血小板活化、黏附、聚集率增加与缺血性脑梗死发病率呈正相关，亦是缺血性脑梗死重要的检测指标之一，以上检测指标的实验研究大多建立在临床及单纯的急性脑缺血模型基础上。相关实验报道［7］显示，大鼠血清中血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍化生长因子-BB（PDGF-BB）在该复合模型中明显增高，AS导致血管内皮损伤后激活血小板使之释放各种生长因子，包括VEGF和PDGF，皇甫斌等［27］采用RTPCR技术分析AS脑缺血模型大鼠脑组织的VEGF mRNA表达量及蛋白含量，发现表达明显增高，并随时间规律性波动，在0.5h迅速升高，6 h出现峰值，12 h及24 h后略有下降但不明显，与以往实验比较，VEGF mRNA及蛋白含量峰值提前至发病后6 h，这可能与AS所形成全身炎症反应有关。在AS基础上发生缺血缺氧时VEGF基因的表达时间及水平较无炎症反应存在时表达时间更短、表达水平更高，这说明AS对缺血性脑卒中时VEGF基因及其蛋白产物的表达有正向调控作用。CD34＋细胞在体内能参与成体动物的血管新生，具有内皮细胞前提特征CD34＋在AS鼠的缺血局部较单纯缺血组表达偏低，外周血EPC计数减少，提示在AS脑缺血大鼠中血管的新生能力较无血管病变基础下缺血的自我修复作用减弱［5］。假性血友病因子（vWF）是血管内皮细胞损伤的特异性分子标志物，vWF增高可促进血小板的粘附与聚集，血栓调节蛋白（TM）具有阻止血小板聚集释放的功能及阻止纤维蛋白形成，实验研究显示vWF、TM在正常大鼠脑组织中无明显表达，但二者在AS基础上的脑缺血大鼠组织表达明显增强，TM随着时间的延长，表达减弱并消失［28］。但缺乏更全面的实验数据来说明该指标为AS脑缺血复合模型的特异性分子标志物。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是低氧应答状态中重要的转录因子，参与机体的病理生理过程。HIF-1α可以诱导糖酵解相关酶类基因的表达，从而促进无氧代谢；上调血管内皮生长因子的表达，促进血管内皮细胞分裂增生，促进血管新生等，以上功能共同作用能够提高机体细胞对低氧状态的耐受能力并保持内环境稳态，夏添等［29］运用免疫组织化学法及RT-PCR技术检测HIF-1α的蛋白表达及其mRNA的表达，研究发现，0.5 h已可见HIF-1α的RT-PCR结果中HIF-1αmRNA阳性高表达，较假手术大鼠表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），缺血6 h达峰值，在12、24 h较6 h无明显差异。免疫组化结果示HIF-1α蛋白表达同基因表达变化规律。提示HIF-1α对AS基础上缺血性脑卒中起保护作用，对AS下发生的缺血性脑卒中的治疗提供了新的途径。

3.6.5 细胞凋亡 研究发现与细胞凋亡密切相关的caspase-3［25］在缺血45 min再灌注72 h后，在海马 CAI区神经元表达增强，早期AS可使caspase-3表达更强，原位末端标记证实了凋亡细胞的表达情况与caspase-3的表达相一致，提示caspase-3表达上调可能在脑缺血的凋亡机制中发挥作用，提示早期动脉粥样硬化可以增加大鼠脑缺血再灌注后海马区的神经元凋亡。

3.6.6 神经递质 姜立先等［30］应用离体高分辨魔角旋转磁共振波谱（HR-MAS1HNMR）技术检测AS兔锁骨下动脉盗血模型海马组织代谢产物 N-乙酰－天冬氨酸复合物（NAA）、胆碱（Cho）、肌酸／磷酸肌酸（Cre）、乳酸（Lac）、γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）等共振峰的变化。研究显示：与普通饮食组及高脂饮食组比较，模型组兔海马区NAA、GABA明显降低（P＜0.05），Glu明显升高（P＜0.05），其他代谢产物变化不明显。其中NAA主要存在神经元和轴突内，可以反映神经元的数量和功能，Glu是兴奋性氨基酸，它的释放可产生神经毒性作用，GABA是抑制性氨基酸，能抑制神经兴奋，对神经毒性起一定的保护作用。该实验采用AS兔锁骨下动脉盗血模型模拟临床AS患者，由于动脉狭窄或闭塞导致的大脑后循环慢性低灌注状态，观察海马神经代谢变化，为AS脑缺血的研究提供了可靠的实验理论依据。

4 讨论

目前，国内外关于单纯AS动物模型和单纯脑缺血动物模型的研究较多，也较成熟，在很大程度上促进了AS和脑缺血病理机制、药物评价、临床治疗等方面的研究。但是单一疾病的动物模型并不完全符合临床疾病的发生、发展，临床多见同时多种疾病共存，大多数脑缺血是在某些基础病变条件下发生的，如AS、高血压、高脂血症、糖尿病等，因此研究复合疾病的动物模型可以更接近临床，更加能模拟临床。随着认识的加深，科研工作者也越来越重视建立复合模型进行实验研究，如AS基础上的脑缺血、高脂血症基础上的脑缺血、糖尿病合并脑缺血等。

但复合模型的建立依然存在一些问题，目前还未建立起被行业所认可的AS脑缺血模型，即“金标准”，也未建立该复合模型的完整评价方法与系统；同时对一些实验指标由于研究的方法和手段、动物模型及观察时间等的差异，所得结论也并不一致；部分建立在AS脑缺血复合模型的实验指标检测结果较简单（如与 BBB、脑水肿发生相关的 MMP-2、MMP-9等蛋白水解酶），未能很好的说明该指标在复合模型中较单一模型的变化特点、趋势及其优势；在以后的研究中，利用复合模型对AS、缺血性脑卒中及实验指标三方面的相关性研究将对缺血性脑血管病的病理机制有更深入的了解，为AS下发生的缺血性脑卒中的治疗提供了新的途径。

与临床紧密结合选择所要检测的实验指标，临床试验证明，高同型半胱氨酸（HCY）致AS引起脑梗死的发生有着密切的关系［31］；多种脂肪细胞因子参与并促进了AS斑块的形成和增加了脑卒中的风险，张帆等［32］临床试验研究发现血清内脏脂肪素、抵抗素、IL-6、IL-8水平与颈动脉斑块不稳定性呈正相关，而血清脂联素水平与颈动脉斑块不稳定性呈负相关，这些指标与脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块的不稳定显著相关，有望成为评价斑块稳定性及预测脑梗死发生的理想生化指标。在类似的复合动物模型上，它们是否能作为评价AS下发生的缺血性脑卒中的评价斑块稳定性及预测脑梗死发生的理想生化指标，以及是否可以作为治疗的新途径，需要进一步探索与研究。

总之，不同的检测指标反映不同的发病及作用机制，在具体实验研究中，应采取多指标相互配合的原则，针对不同的作用机制选取，才能更准确反映出该疾病的本质。以上实验方法从AS脑缺血／再灌注的某些发病机制出发建立了相应的动物模型及相关检测指标，为探索和研究AS脑缺血／再灌注动物模型提供了良好的科学依据与研究思路，结合临床发病机制及病变特点建立更加符合人类疾病的动物模型将具有重大意义及重要价值。

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