沙门菌分型技术研究进展

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（扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

沙门菌分型技术研究进展

李昱辰，程瞾，蔡银强，焦扬，潘志明，焦新安

（扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

沙门菌在自然界广泛分布，是人和动物常见的病原菌，可引起人和动物伤寒、副伤寒、胃肠炎、败血症和局部感染等多种疾病。沙门菌分型方法分为以表型特征为依据的表型分型和以基因或基因组结构特征为依据的分子分型。本文不仅回顾了传统的分型方法，还重点介绍了最近发展迅速的多种分子分型方法，可为沙门菌的分型研究提供参考。

沙门菌；表型分型；分子分型

沙门菌在全球广泛分布，寄生于人和动物体内，也常见于污染的蛋、奶、肉类等食品，对公共卫生安全危害极大。全球每年估计发生将近13亿因沙门菌导致的急性胃肠炎病例，其中300万患者死亡。沙门菌感染也一直位居我国细菌性食物中毒的首位，约占感染总数的64%[1]。因此，采用有效的分型方法对细菌进行分类，对人和动物沙门菌病感染源的确定以及控制并减少发病率具有十分重要的意义。

传统的细菌分型方法大多是基于细菌的一些表型特征，这些常规方法在传染病暴发时期的分型工作中发挥了重要作用，如血清学分型操作简便快速、重复性好、有商品化试剂，实际应用中有着重要价值，一直被作为沙门菌常规检测的一部分。但表型分型存在诸多局限性，不能满足传染病跨地区传播流行病学调查、追踪、溯源的需要。分子分型方法以其特异性强、重复性好、敏感性高和分辨率佳的优点，逐步取代传统表型分型技术，在沙门菌诊断与分型中发挥巨大作用。本文就近年来国内外对沙门菌具有代表性的分型方法作综述，对其优缺点进行阐述，旨在为沙门菌的快速、有效分型提供参考。

1 沙门菌表型分型技术

1.1 沙门菌血清学分型

血清学分型作为沙门菌最常用的表型分型方法，已鉴定出2500多个不同的沙门菌血清型。由于具有较高的遗传相似性，因此WHO国际沙门菌协作和研究中心将沙门菌属分为肠道沙门菌和邦戈尔沙门菌2个种，并将肠道沙门菌分为亚种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ和Ⅵ6个亚种[1]。此方法直观可靠，但仍存在一些缺陷，例如实验较为烦琐、主观性较强、鉴定时间长等。另外，免疫鉴定主要是依靠血清与沙门菌抗原决定簇的特异性反应，但沙门菌多达2500多种血清型，如果反应特异性不强，如同时识别多个抗原或识别相应的抗原失败，就会造成血清型分型结果的错误[2]。因此，越来越多的研究人员尝试应用新型技术进行沙门菌的血清分型，从而使鉴定方法更加快捷而有效。例如刘斌等发掘了沙门菌血清组A-D和伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌等8种常见血清型沙门菌的特异PCR检测靶点，并以此分别建立了血清组和血清型多重PCR检测体系[3]。

1.2 噬菌体分型方法

根据噬菌体对宿主菌的高度特异性，即一种噬菌体只能裂解一种与它相应的细菌，因此常用该方法对未知细菌进行鉴定和分型，但噬菌体感染和裂解细菌的能力与噬菌体分子特征及位于细菌表面的受体有关。

噬菌体分型方法通常用于分析近源沙门菌（如同一血清型）。噬菌体分型在沙门菌大流行克隆的研究中显示出明显的作用，Boxrud等使用一个由10种噬菌体组成的分型系统对美国人源、动物和食物等来源的573株肠炎沙门菌进行分型，最常见的噬菌体型为8（48.2%），13a（20.1%），13（7.8%）和14b（7.8%）。大部分菌株噬菌体型都与美国北部蛋来源的沙门菌病暴发相关，这说明污染蛋类中的沙门菌可能是上述样品中沙门菌大量分布的来源[4]。但噬菌体分型存在着不足，如操作烦琐、人为因素影响大、重复性较差、难以标准化和噬菌体种类的限制导致部分细菌无法分型等问题。因此，只有在噬菌体储备维护良好并且有特别训练过的实验人员的实验室开展噬菌体分型，其结果的准确性才能有所保证[5]。

2 沙门菌分子分型技术

2.1 多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）

MLST技术于1998年由Maiden首先提出，主要基于管家基因或毒力相关基因的等位多态性进行分型。通过PCR扩增细菌病原微生物个体7个或更多管家基因内部约450bp产物，通过测序，获得核苷酸序列特征，根据序列不同分别对不同管家基因的等位基因分配基因序号，管家基因的序列组合决定菌株特异性的序列型别（sequence typing，ST）。MLST选用的管家基因的数量一般是7个或者更多，但也有文献报道基于3-4个管家基因的MLST分型试验，如Mamuka等选择了基于16SRNA，pduF，glnA和manB 4个基因的MLST方法对临床和环境中的沙门菌进行分型，发现其分型能力要强于脉冲场凝胶电泳（Pulsed feld gel electrophoresis，PFGE）[6]。研究还发现MLST结果与其他分型方法结果存在较高的一致性，如Sukhnanand等设计的基于manB，fmA 及mdh基因的MLST方法，对临床相同的血清型有一定的区分力的同时，对沙门菌血清型也能实现较为精确的预测[7]。

MLST在沙门菌溯源中具有重要的作用，其获得了管家基因内部DNA的确切变异，使不同实验室之间的结果比对变得十分便捷。对于许多细菌种属包括沙门菌，已有多个联网MLST数据库，尤其是网络化MLST数据库（http：//www.mlst. net/）使得细菌病原菌全球化的MLST分子流行病分析更为快速、可行。但是MLST主要是通过管家基因变异进行分型，由于管家基因高度保守（突变积累很慢），所以其在区分高度关联的菌株时还存在一定的缺陷，不仅对血清型相同的菌株区分能力较弱，甚至对不同血清型但遗传关系较近的菌株也难以很好地区分[8]。近年来，MLST技术发展了基于毒力基因和其他结构基因的沙门菌分型技术。如Liu等基于毒力基因sseL、fmH 和规律成簇的间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）位点对171株沙门菌进行分型，通过增加CRISPR序列长度，这种新的MLST分型方法区分能力优于PFGE分型，具有高度的流行病学一致性，能够用于调查区分暴发的菌株[9]。

2.2 可变串联重复序列分析（multiple locus VNTR（Variable-Numbers tandem repeat） analysis，MLVA）

随着二代测序技术的发展，人们已完成了大量细菌的全基因组测序，发现大量细菌基因组中含有短小重复DNA序列组成的多重区域，这些重复序列长度从几个碱基到超过100 bp不等。这些差异随菌株的不同而不同，而这些多态性的片段常称为VNTR。基于VNTR的重复单元拷贝数的差异性来进行分子分型的技术就称为多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）。MLVA技术操作简单、容易掌握、重复性好、快速高效，易于在不同实验室推广，PulseNet已将MLVA列为第二代分子分型方法，并应用于多种细菌包括沙门菌的分子分型研究。与MLVA相比，PFGE信息的获取需要标准化的实验设备和操作步骤，因此在一些情况下MLVA比PFGE更为敏感。Tien等对55株分离自南亚和东南亚的2000—2010年的甲副菌株进行XbaI 和BlnI两种限制性内切酶的PFGE分型，并应用基于6个位点的MLVA分型，共分成14种PFGE型别，23种MLVA型别，MLVA分辨指数0.937明显大于PFGE分辨指数0.741[10]。

MLVA在理论和技术方面都还处在发展和完善阶段，如不同血清型MLVA引物的分辨率不同，筛选合适的MLVA位点还不能依赖其他血清型公布的基因组序列。因此尽管已有伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等血清型的MLVA的标准方法公布，但这远不能满足沙门菌近2500多个血清型的分型需求。

2.3 脉冲场凝胶电泳（Pulsed feld gel electrophoresis，PFGE）

PFGE是20世纪80年代中期发展起来的常用于大分子量线性DNA的分离一种电泳技术，其方法主要是将细菌包埋于琼脂块后，选取合适的内切酶对其染色体进行酶切，分子量不同的酶切片段能在方向、时间与电流大小交替改变的脉冲电场中得到良好的分离。

PFGE具有重复性好、特异性高、分辨力强、易于标准化等优势，可用于分析菌株之间的相关性，在溯源及疫情控制中发挥着重要的作用，被誉为细菌分子分型研究的“金标准”。1996年由美国CDC 首先发起、建立的实验室分子分型监测网络PulseNet，就是通过分析分离株的DNA的指纹图谱（PFGE技术）以及网络信息共享发展起来的，现已实现对北美、欧洲、亚太、中东等地区的全球化实验室网络覆盖。其在大肠杆菌O157：H7、沙门菌和李斯特菌等常见致病菌的监测、预报及暴发后来源的确定中发挥着重要作用。例如美国CDC通过PulseNet食源性监测网对地理上分散，年龄和性别分布具有典型性的同一PFGE带型蒙得维的亚血清型沙门菌感染进行调查，通过病例对照研究，证实病例感染与食用污染的腊肠有关[11]。Marcus等对2005-2011香港239株医院来源及546株中国疾病预防控制中心传染病研究所保存的人源鼠伤寒沙门菌分离株进行分子分型研究，发现CN006型的ST34鼠伤寒沙门菌及其相关的克隆与ACSSuTCip-oqxAB-aac（6’）Ib-cr 型鼠伤寒沙门菌在中国临床上的大量出现有着重要的关系[12]。

由于所需设备仪器昂贵、操作复杂、实验周期长，需要专业的操作人员等原因，这在一定程度上限制了PFGE技术在一般实验室中的推广应用。

3 不同分型方法的联合应用

不同的分型方法都有其优点和缺点，这会影响到它们在确定沙门菌分离株来源和亲缘关系时的准确性。为有效地确定沙门菌的克隆性和遗传相关性，通常结合使用多种分型方法，研究表明这在鉴别近源株时非常有价值。如Dudley等发现将PFGE与CRISPR-MVLST相结合，能大大提高人源的肠炎沙门菌的区分能力[13]。而Atsushi等发现MLVA与PFGE联合使用能提高牛源的鼠伤寒沙门菌和4，5，12：i：-沙门菌的分子分型能力，并且能在这些血清型的同一克隆中较为清楚地确定不同的克隆亚型[14]。日常监测中，可先应用血清分型来分类沙门菌分离株，之后应用如抗生素敏感实验和噬菌体分型等表型分型方法来进一步确定病原体。再使用PFGE，MLVA，MLST等分子分型技术进一步鉴别引起食源性疾病沙门菌菌株的亲缘相关性。因此选择合适的分型方法以及合理安排所选方法的顺序能够帮助实现沙门菌分型能力的最大化。

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Progress in research on Salmonella typing methods

Li Yuchen，Cheng Zhao，Cai Yinqiang，Jiao Yang，Pan Zhiming，Jiao Xinan
（Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis/Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou University，Yangzhou 225009）

Salmonella is distributed widely in nature，one of the common pathogenic bacterium both in people and animals. It can cause typhoid fever，paratyphoid fever，enteritis，septicemia and localized infection in humans and animals. There are many methods in Salmonella typing，which could be divided into phenotype typing based on phenotypic characterization and genotyping based on the structure character of genes or genomes. Beside the traditional Salmonella typing methods，the paper reviewed and introduced the recently-developed molecular typing methods，which can provides reference for Salmonella typing.

Salmonella；phenotype typing；genotypin

R378.2

：A

：1005-944X（2014）06-0032-04

公益性行业（农业）科研专项（201403054）、863课题（2012AA101601-6）、江苏省“六大人才高峰”（2012-NY-028）、江苏省高校青蓝工程中青年学术带头人培养对象、江苏高校优势学科建设工程

潘志明