牙骨质附着蛋白在牙周组织再生中的作用

潘文波 林 鹏 郑文娥 姜艳华 (吉林大学第二临床医院检验科，吉林 长春 300)

牙周病是一种常见的口腔疾病，在老年人中发病率高。牙骨质为覆盖在牙根表面的一层硬组织，维持着牙周组织的稳定与健康。新生牙骨质的形成对于牙周组织再生具有重要意义，与老年人牙周病的治疗密切相关。牙骨质附着蛋白(CAP)是牙骨质中的一种特异性蛋白〔1〕，具有促进牙骨质形成的作用〔2〕，因此CAP在牙周组织再生中发挥着重要作用。CAP的发现是牙周组织再生机制的一个重要补充，为老年人牙周病的治疗提供了新思路。

1 CAP的分子生物学特性

早在1987年，Miki等〔3〕发现新鲜人牙骨质提取物具有刺激牙龈成纤维细胞有丝分裂及DNA合成的作用，其中分子量55×103的蛋白活性最高，能显著促进牙周韧带细胞和牙龈成纤维细胞等对牙根的附着，由此被命名。Arzate等〔4〕首先制备了针对这一蛋白的鼠源性抗体H166;随后Saito等〔5〕从牛牙骨质中提取CAP并制备了单克隆抗体——3G9，借助这一抗体，陆续证实CAP只在牙骨质细胞、成牙骨质细胞(CB)及间充质干细胞中表达，提示CAP在牙骨质的形成中发挥着重要作用。对CAP的结构分析显示CAP含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，具备典型黏附蛋白的特征。GenBank数据库显示编码人CAP的基因是PTPLA，并收录了其编码基因序列(Gen-Bank登记号为AY455942)，但该编码序列并未见诸学术报道，其可靠性有待研究〔6〕。CAP是与牙骨质表面已发现的、与其他胶原分子及附着蛋白无关的牙骨质特异性蛋白〔7〕。因为CAP上述独特的组织学表达特点，目前被认作是CB及牙骨质的分子标志物〔8〕，并建立了多种分离提纯的方法〔9〕。

2 CAP的生物活性及作用机制

2.1 生物活性 CAP具备典型黏附蛋白的特征，对牙骨质表面的黏附性优于牙本质表面，对羟磷灰石的亲和力高于胶原蛋白〔10〕。CAP可以选择性地促进牙周组织中具有成骨表型细胞的黏附及增殖，例如人牙囊细胞(hHDFCs)、牙周韧带细胞(hPDLSCs)、牙龈成纤维细胞(HGFs)、牙槽骨细胞(hHABCs)，但CAP对这些细胞的伸展并无显著影响〔9〕。CAP对上述细胞的促增殖作用呈浓度和时间依赖性，例如0.5～2.0 μg/ml的CAP能显著促进 hPDLCs增殖〔11〕。CAP还可促进骨髓基质细胞(BMSCs)增殖，但对细胞矿化无明显作用。CAP内的RGD序列可以通过整合素 α5β1与成纤维细胞相结合〔12，13〕，增强其细胞黏附性，且细胞黏附不为抗纤维连接蛋白和抗层黏连蛋白等抗体阻断〔11〕。同时CAP可以影响人牙囊细胞内源性骨涎蛋白(BSP)基因的表达，该作用具有剂量效应和时间效应:CAP浓度越大，表达量越强，但是剂量效应还受到时间效应的制约，即使CAP浓度高达10 mg/L，3 d也未观察到BSP mRNA表达。体外实验显示CAP在高浓度时可增强人牙囊细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性〔14〕，促使其黏附并向CB分化，刺激其分泌矿化基质，从而形成早期的牙骨质和骨组织;另有实验证明能强烈结合CAP的细胞可以形成牙骨质样结构〔7〕。

上述研究表明CAP能选择性地促进CB前体细胞对牙根表面的移行黏附〔2〕，并促进这些前体细胞向CB系分化，增强其成骨活性〔14〕;CAP是新生牙骨质及牙周再生的趋化因子，并参与牙周新附着的形成。

2.2 CAP的作用机制 Francisco等〔15〕发现细胞外调节激酶(ERK)的增量调节是牙骨质形成的关键，Ca(OH)2使胞外钙水平提高，通过ERK信号转导途径促进牙周膜中CB分化，当钙通道阻断后，ERK磷酸化被阻止，CAP则无法释放，提示ERK信号转导途径参与CAP形成。而CAP介导的成纤维细胞伸展过程则有MEK/MAPK信号传导途径参与，Kamoki等〔16〕发现ERK在成纤维细胞附着发生15 min后被激活，3 h后达到顶峰水平，激酶活性至少可维持12 h以上;而MAPK激酶抑制剂PD98059可显著抑制细胞附着后激发的激酶活性水平，明显抑制成纤维细胞的进一步伸展。

Saito等〔17〕研究人成纤维细胞附着于 CAP过程所引发的信号反应，发现该过程可激发MAPK激酶活性、引发c-fos mRNA的表达及蛋白酪氨酸磷酸化反应，提示CAP介导的细胞附着过程可引发与纤维连接蛋白(FN)等其他黏附分子类似的典型信号活动，从而在病理状态下选择性募集间充质细胞迁徙、附着，并调节细胞的特异性生物功能的发挥。整合素α5β1亚单位是CAP介导细胞附着的主要受体，Ivanovski等〔18〕发现细胞的附着行为可被抗α5及抗β1抗体所抑制，而不受抗α2及抗α3抗体的影响。CAP通过影响cyclins D1及E对细胞周期进行调节，Yokokoji等〔19〕在研究cyclins D1及E与成纤维细胞结合CAP后细胞周期变化的关系时，发现虽然CAP与成纤维细胞结合后，cyclins D1及E水平都显著升高。Pan等〔20〕发现Runx2作为成骨细胞及成牙骨质细胞增殖早期重要的转录因子，可以促进CAP的分泌，并且与CAP促进CB增殖的功能密切相关，提示Runx2参与CAP促进成骨表型细胞增殖的过程。

3 CAP与牙周组织再生

新生牙骨质的形成对牙周组织再生意义重大，CB在牙骨质形成中发挥着关键作用。CB的功能包括表达矿化相关蛋白如骨钙素(OCN)、BSP、CAP等，分泌矿化基质形成钙化结节，进而形成牙骨质;CB表达的OCN、BSP和CAP等在牙骨质形成和细胞黏附过程中起重要作用。上皮根鞘(HERS)是牙根发育中的重要且唯一的上皮性结构，在牙根发育中发挥着重要作用。Jimin等〔21〕发现上皮根鞘细胞不仅分泌釉基质蛋白，也分泌CAP参与牙骨质形成。

CAP可作为鉴别CB及牙骨质的分子标志物〔22〕。同时众多实验证实〔23～25〕:牙囊细胞、牙周韧带细胞等具有分化为CB潜能的间充质细胞在分化过程中同样表达CAP，因此CAP亦可作为鉴别牙周韧带中具有分化为CB潜能的间充质细胞的特异性标志;而细胞ALP表达可以作为牙骨质形成过程中CB分化早期的标志;矿化组织的形成则可作为CB分化末期的指标。Handa等〔26〕将牛牙囊细胞与羟基磷灰石复合后植入免疫缺陷小鼠体内，4 w后发现形成纤维组织和类牙骨质样基质，CAP染色阳性;而植入的牙槽骨细胞生成的是骨样结构，CAP染色阴性。Wen等〔27〕发现在经含牙本质非胶原蛋白的牙囊细胞培养液处理后，脂肪干细胞由成纤维样细胞转变为成牙骨质样细胞，细胞表达CAP mRNA。周彬等〔23〕发现在纯钛表面生长的hPDLCs能高度表达CAP，提示体外培养的hPDLCs中存在牙骨质细胞表型，具有向CB表型分化的潜能。Song等〔2〕利用hPDLCs探讨根面原位保留的牙骨质对其分化的影响，以期进一步揭示牙骨质的功能，并为临床应用中根面保留牙骨质提供理论依据，研究表明在同样条件下生长的hPDLCs，在牙骨质表面生长的hPDLCs显著表达CAP，证明根面保留的牙骨质能促进hPDLC向CB分化，从而有利于牙周组织再生。Bo等〔22〕发现牙本质基质(TDM)可以促进牙囊细胞分化为牙髓牙本质样组织及牙骨质-牙周复合体，CAP作为牙骨质形成的标志物之一用于鉴定所形成的牙骨质结构。

目前，普遍观点认为釉基质蛋白(EMPs)可以促进牙周膜细胞(hPDLF)的增殖及矿化相关蛋白如 BSP和骨桥蛋白(OPN)的表达〔28〕，而黄晓山等〔29〕发现 EMPs还可通过增强 hPDLF中CAP的表达从而促进hPDLF向CB分化，进而促进牙周组织再生。骨形成蛋白(BMP)是启动间充质干细胞向成骨细胞分化的初始信号分子，刺激牙槽骨及牙骨质再生从而促进牙周组织修复;而BMP-2促进牙骨质再生的机制之一是BMP-2能够通过增强CAP的表达来调节CB分化。Pitaru等〔30〕研究了BMP-2对不同牙周韧带前体细胞克隆的分化及CAP表达的影响，发现矿化组织形成细胞系有较高的CAP结合力，未被BMP-2处理的成纤维细胞系对CAP结合力较低，经BMP-2处理后上述两种细胞系的CAP结合力均有所提高。随后Zhao等〔25〕、Hidefumi等〔31〕陆续证实:BMP-2、7 和 EMPs可以刺激HDFC分化为CB，并表达 CB标志物 CAP。Carmona-Rodríguez等〔32〕发现经牙骨质蛋白(CEMP)-1转染的人类牙龈成纤维细胞(HGF)表达CAP mRNA，提示CEMP-1促进矿化及牙骨质形成的机制与促进CAP的表达有关。

综上，CAP在牙骨质的形成中发挥着重要作用，是牙周组织再生中的重要趋化蛋白，这为老年人牙周病的治疗提供了新的思路。但目前只获得了抗人或牛的CAP抗体-3G9〔5〕，研究所用的实验动物往往受到CAP抗体的限制，同时CAP的作用机制尚未完理解透彻，需要进一步的探索。

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