布鲁氏菌TIR结构域蛋白TcpB的研究进展

雷霜霜，钟志军，彭广能

布鲁氏菌病(brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种可累及全身多个系统并有潜在致命危险的动物源性传染病，主要依靠受感染动物以及受污染动物产品进行传播。人和动物感染后主要呈现流产、不孕、空怀、睾丸炎及关节炎等症状。布病在世界各地广泛流行，全球每年因布病造成的经济损失近50亿美元[1]。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，其基因组中无质粒，仅有大小不同的两条染色体，胞内生存与复制是布鲁氏菌主要的毒力特征[2]。一直以来，布鲁氏菌独特的致病机制是研究的重点和热点。

病原菌通过其毒力蛋白以多种方式破坏宿主先天和适应性免疫反应，其中重要的方式之一便是通过接头蛋白(adaptor protein)作用于宿主重要信号通路中的关键分子，如含TIR结构域蛋白(Toll/IL-1 receptor-like domain-containing protein)。目前，研究已发现多种病原菌含有TIR结构域蛋白，如Salmonellaserovar[3]、uropathogenicEscherichiacoli(UPEC)[4]、Staphylococcusaureus[5]、Yersiniapestis[6]等。布鲁氏菌能分泌TIR结构域TcpB(TIR domain-containing protein inBrucella)，它又被称为Btp1(BrucellaTIR domain containing protein)[3,7]，至少在羊种布鲁氏菌(Brucellamelitenis)、牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)和绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucellaovis) 3种布鲁氏菌中发现存在TcpB。近年来的研究发现，TcpB作为1个重要的毒力因子，在逃避宿主免疫应答过程中发挥重要作用，具有多种免疫调节功能，可减少树突状细胞活化，并抑制其活性，并且抑制促炎细胞因子分泌，在调节微管组装动力学方面也有显著作用[9]。

1 布鲁氏菌TIR结构域蛋白

1.1TIR结构域的组成特征 TIR结构域首先在真核生物中发现，其中包括非常重要的TLRs(Toll Like receptors)，均以TIR结构域为其重要特征之一。真核和原核生物中的TIR结构域通常包含150～200个氨基酸残基，其序列可分为3部分，包括：5个α螺旋、5个β折叠以及连接它们的8个柔性肽段[3]。所有TIR结构域有共同的序列基序：box1(F/ Y)-DAFISY、box2(GYKLC-RD-PG)和box3(1个保守的W由碱性残基包围的部分)，其中box1和box2对于蛋白的功能至关重要，而box2的BB循环是TIR结构域功能最重要的区域[10]。定点诱变研究表明，BB循环中一些残基是TLR信号转导的关键。TIR结构域的结构高度保守，但也存在一些构象差异，TLR1与TLR2中的TIR结构域序列同源性为50%[15]。TIR结构域位于蛋白的C-末端或N-末端区域，其余区域高度可变。这种结构的多样性对于介导不同的信号通路起着关键作用[11]。

1.2细菌中的TIR结构域蛋白 生物信息学分析表明，922种致病性和非致病性细菌中包含TIR结构[12]。在金黄色葡萄球菌，马尔他布鲁氏杆菌和沙门氏菌肠炎血清型等大范围的细菌中，Newman等鉴定出200多种TIR类似结构[3]。生物物理特性分子模拟实验初步表明细菌TIR结构域蛋白与TLRs的TIR结构域在结构上存在很高的同源性[7]。细菌TIR蛋白大约含230-310个氨基酸，其中保守部分占150-200个氨基酸。TIR结构域的重要功能是介导与含TIR结构域蛋白的结合，细菌TIR结构域蛋白大多作用于宿主TLR信号通路中含TIR结构域的TLR受体(TLR1-13)以及其下游的5个接头蛋白MyD88、MAL、TRIF、TRAM和SARM[13]。来源于沙门氏菌肠炎型的tlpA 蛋白( TIR-like protein A)，该蛋白能够抑制哺乳动物TIR结构域蛋白的能力，如Toll样受体，IL-1受体，反式激活MyD88以及NF-κB的DNA结合活性，从而下调TIR信号通路[3]。TIR结构域蛋白C(TcpC)在常见的人类肾盂肾炎大肠杆菌中得到鉴定，Snydera等在结构上证明TcpC与MyD88和TLR4结合，通过其DD和BB循环损害TLR诱导的细胞因子[4]。数据库显示在金黄色葡萄球菌MSSA476中存在编码类似人TIR结构域的基因，被命名为金黄色葡萄球菌TIR结构域蛋白(TirS)。Askarian等在人胚胎肾细胞，巨噬细胞和角质形成细胞的细胞系中异位表达TirS，发现其干扰TLR2信号，包括MyD88和TIRAP，NF-κB以及有丝分裂原活化蛋白激酶途径[5]。Tdps在高致病性细菌鼠疫耶尔森氏菌(YpTdp)中鉴定出来，Rana等通过表达一些不同长度的YpTIR，对TIR结构域进行了生物物理特性和功能分析[6]。

1.3布鲁氏菌TcpB的结构特征 Snyder等对TcpB晶体结构做了一些探讨Radhakrishnan等对TcpB生物活性和功能方面也做了相关研究[14,17]。Kaplan-Türköz等在3.15Å分辨率下观察到TcpB的晶体结构，发现TcpB的晶体结构中有一个独特的α尾巴环绕两个TIR结构域的二聚物[15]。这种相互作用第一次在TIR结构域中观察到，加强了AB二聚体生理学相关的假设。它表明全长的TcpB二聚体是不对称的，即N-末端域可能彼此相互作用独立形成功能单元。由于N-末端形成螺旋线圈，连接1个α尾巴与TIR结构域形成的环显得非常灵活，所以在溶液中不同全长蛋白二聚体也可能存在。布鲁氏菌TIR结构域TcpB 蛋白的结构显示与PdTIR最相似而DE环是更类似哺乳动物MyD88和TIRAP[15]。

2 布鲁氏菌TcpB的功能

2.1抑制树突细胞活化 树突细胞(Dendritic cells，DC)是介导病原体识别的典型代表，有从外周组织到次级淋巴器官的迁移能力，引起原发性T细胞反应。DC能表达多种病原体识别受体如C-型凝集素和Toll样受体(TLRs)，识别分子模式，决定免疫反应类型。然而，一些细菌病原体能破坏DC的功能，从而逃避免疫系统的监测。很多研究使用巨噬细胞和胎盘滋养层细胞作为布鲁氏菌感染模型，但最新研究表明，布鲁氏菌能在人单核细胞源性DC中复制，DC可构成一个重要的细胞内环境以促进感染[9,16]。在哺乳动物细胞中过表达TcpB，发现DC出现皱缩，变圆等变化[18]。

大多数病原体可在淋巴结滤泡区域或固有层中相邻的绒毛区观察到，而布鲁氏菌以一种类似在巨噬细胞和非吞噬细胞内进行体外培养的方式，建立一个DC内复制环境。研究表明，细菌感染的DC通常与它们活化和成熟表型相关联。成熟的DC可以通过细胞表面的MHCII级分子，微管收集中心(MTOC)周围大量聚集的多泡体(MVB)以及一种新合成的泛素化蛋白质大胞树突状细胞形成聚集小状感应结构(DALIS)来表征[11]。沙门氏菌感染的DC很好地证明了这种情况，MHC II级分子大多定位在细胞表面和MVBs大量聚集在MTOC。但大多数布鲁氏菌感染的DC并没有显示任何成熟迹象，因为布鲁氏菌轴承细胞很少显示溶酶体集群，MHCII级分子细胞表面很少积累。尽管DALIS的功能尚不清楚，使用FK2抗体能很容易检测识别单个泛素化的蛋白质，为监测DC的成熟提供了一种有效的方法。布鲁氏菌感染DALIS的平均数量远小于在沙门氏菌中形成的DALIS。这些结果说明布鲁氏菌在DC中复制可能限制DC的成熟过程。Salcedo等在感染的早期，用小鼠肠道循环模型来表征布鲁氏菌在胞内的靶点，发现DC是布鲁氏菌早期感染时胞内一个潜在的细胞靶标。采用小鼠骨髓源树突状细胞(DC培养上清)作为模型，发现布鲁氏菌在DC细胞中复制，抑制DC的成熟过程，最终导致细胞因子TNF-a,IL-12 (p40/p70), IL-6以及IFN-b 分泌减少，从而影响抗原的递呈和抗原递呈细胞的数量[8]。

2.2抑制NF-κB信号通路 核因子κB(NF-κB)是1种广泛存在于真核细胞内基因多向性转录因子，属于Rel家族，1986年首次在小鼠B淋巴细胞的核抽提物中发现，NF-κB/Rel家族成员N端都含1个高度保守的，由300个氨基酸组成的Rel同源结构域(Rel homology domain,RHD)。大部分NF-κB二聚体为转录激活因子，是免疫激活必不可少的信号。然而，细菌病原体通过进化以直接干预或模仿宿主细胞信号蛋白，从而有利于在宿主内持续性感染。Cirl等发现布鲁氏菌编码的结构域蛋白TcpB能有效抑制由TLR2，TLR4介导的NF-κB的激活和促炎性细胞因子的分泌[7]。Radhakrishnan等采用浓度递增的MBP-TcpB聚合物以及单独使用MBP孵化巨噬细胞，诱导后NF-kB的活性引起IkB磷酸化，进而导致它们解离，发出降解信号，诱导基因表达。IκBa刺激细胞降解表明NF-κB的激活，内化的MBP-TcpB能够抑制IκBa的解离，IκBa能抑制NF-kB的活性，从而证明了TcpB损害TLR2，TLR4介导的NF-κB的活性[17]。此外，TcpB序列分析显示，TcpB与衔接分子TIRAP存在中等水平相似度，后续实验证明TcpB能与质膜和微管共定位，通过其N-末端结构域磷酸肌醇作用于TIRAP来抑制NF-kB的活性[17]。TcpB可能内化后由布鲁氏菌囊泡分泌，穿越囊泡膜转移到TLR信号通路靶蛋白上抑制NF-kB的活性。

2.3抑制微管的组装 微管参与细胞多方面应答，包括细胞分裂，迁移和细胞内信号转导。微管网是一种重要的信号转导组分和组装途径，微管的稳定性直接影响细胞多种信号传导过程[17]。亚细胞定位研究表明，TcpB大部分定位于质膜和微管。研究发现TcpB诱导微管增厚，TcpB修饰的微管表现出耐抗肿瘤药诺考达唑诱导的解聚作用[18]。研究证明TcpB需要1个完整的TIR结构域微管网才能抑制TLR信号通路，维持其正常活性。BB循环是1个次级TIR结构域，TLR与衔接分子之间相互作用的蛋白质。维持微管稳定特性区域位于TcpB的BB循环，包含124-176氨基酸，同时这部分也是抑制TLR不可缺少的。缺失BB循环突变株，TcpB微管结合以及微管稳定能力都减弱。Radhakrishnan等采用免疫荧光法以及共同沉淀测定法，体外进行微管结合实验，进一步确定TcpB与微管的相互作用，发现MBP-TcpB能与微管结合，由于MBP本身不存在与微管任何亲和力能力，说明该微管结合能力是由TcpB融合蛋白产生的[18]。多数MBP-TcpB存在于含微管结合的小碎片中，表明微管与TcpB之间存在重要的相互影响。

紫杉醇是一种微管稳定剂，可降低聚合微管蛋白的临界浓度，提高聚合稳定微管的能力。Xiao等实验表明，TcpB与紫杉醇具有相似的性质[19]。类似于紫杉醇，TcpB加速微管的成核和生长阶段的形成和稳定微管，能够抵抗低温诱导微管的解离，证明TcpB具有高效的稳定微管的性质。TcpB与微管相互作用以及微管稳定特性的生物学意义目前还不明确，可能是TcpB诱导微管沿着微管轨道聚集进而干预囊泡运输，从而有利于布鲁氏菌逃脱吞噬体-溶酶体融合以及吞噬体查杀。

3 TcpB作用的分子机制

3.1与MyD88的作用 病原体采用多种机制逃避宿主的免疫反应。由TcpB介导的免疫逃避机制尚未完全阐明，TcpB在宿主中的靶点也存在争议。值得注意的是，TcpB类似MAL/TIRAP的功能，结合质膜通过N-氨基PIP2(磷脂酰肌醇4,5 -二磷酸)从而影响MyD88的功能[18]。Cirl和他的同事研究证明，在HEK293细胞中TcpB与内生性MyD88相互作用[3]。Weiss等研究表明，对于受感染宿主MyD88是宿主清除布鲁氏菌至关重要的[20]。最近，有报道表明能与TcpB免疫共沉淀，转染的是TIRAP，而非MyD88[21]。Cabantous等用基于绿色荧光蛋白和Gaussia荧光素酶蛋白质片段互补测定(PCAs)法，探测到与TcpB直接相互作用只有MyD88与TIRAP，且与MyD88的相互作用强于TIRAP[22]。此外，TcpB-MyD88的相互作用不阻止MyD88同型二聚体化，但需要下游激活IRAK激酶[23]。除了羧基末端TIR域，MyD88还含有1个氨基端死亡域DD。TcpB能作用于MyD88 DD从而破坏MyD88DD以及MyD88DD与MyD88TIR之间的信号传递。研究结果表明，MyD88 DD和TIR结构域未开放的接口可调节MyD88的活性，病原体可能针对这个接口逃避先天免疫。宿主接头蛋白MyD88直接干扰布鲁氏菌蛋白质TcpB取决于DD中的MyD88，而不是TIR结构域，TcpB抑制这种相互作用以及单独DD的自我相互作用，但TcpB不抑制全长的MyD88二聚体。早期的酵母双杂交实验中，发现MyD88DD和TIR结构域存在新的相互作用，单独的MyD88TIR结构域能结合到全长MyD88，而非单独的DD[20,23]。然而，在含有这两个结构域的折叠的小蛋白质中，它极有可能存在由两个结构域介导蛋白质的接口。在MyD88DD和TIR结构域之间分子内的相互作用，可以起到调节MyD88结合功能，这种相互作用通过TcpB表现出功能上的意义需要进一步阐明。在先前的研究中，发现全长的MyD88或MyD88DD过表达能增强NF-κB的活性，但TcpB本身抑制NF-κB的活性[22]。全长的MyD88和MyD88TIR都不能通过TcpB解除对NF-κB抑制，而DD却有显著作用。从生物化学上角度思考，这些结果提供了关于TcpB与MyD88相互作用的机制很好的见解。

3.2与MAL的相互作用 近来已经证实，MAL包含1个N-末端磷酸肌醇结合结构域，允许其从胞质外招募MyD88，在质膜上靶向接近TLR2和TLR4。抑制细胞因子-1(SOCS-1，一种E3泛素连接酶)可通过负向MAL的降解信号调节TLR2和TLR4泛素依赖过程[24]。Lavigne等人为了测试TcpB是否能增强泛素依赖过程从而降解MAL，在蛋白酶体抑制剂MG132存在和不存在两种情况下，表达HA-MAL，TcpB，和VSV-泛素。发现表达的MAL自身泛素化在一个较低的水平，但在TcpB存在的情况下，泛素化程度大大增加。这表明，磷酸化形式的MAL被TcpB泛素化降解。然而，不像SOCS-1，TcpB没有与已知泛素连接酶存在明显相似性[25]。因此，目前还不清楚TcpB本身是否能增强泛素化MAL，还是它能招募一些其他泛素连接酶，所以TcpB本身能否通过泛素化引起MAL降解，相关功能结构域仍有待确定。

要确定在感染布鲁氏菌的哺乳动物细胞中TcpB是否对MAL水平有影响，Sengupta等进一步评估了此蛋白在小鼠巨噬细胞样细胞系的水平(J774感染强毒布鲁氏菌株2308和等位基因TcpB缺失突变体指定为KB2)[21,24]。相比之下，感染流产布鲁氏菌比感染KB2显示MAL的水平显著下降，这些结果进一步证明TcpB导致MAL的降解。重组布鲁氏菌TcpB表达在哺乳动物的活性细胞中，发现MAL的活性明显受到影响。通过降解MAL，TcpB减少可用磷酸化MAL的量，从而减弱信号，但没有完全关闭信号系统。在小鼠巨噬细胞系，没有检测磷酸化形式的MAL，TcpB可以简单地通过降解它们减少可MAL的量来发挥同样的效果。Sengupta等研究结果却与Cirl等的研究不一致，他们提出TcpB只干扰 MAL/TIRAP而不干扰TcpB-MAL/TIRAP相互作用。同样，在HEK293细胞中，TcpB 减少MAL/TIRAP表达，增强MAL/TIRAP泛素化和降解[22]。

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