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禽流感病毒的监测及诊断

2014-01-25谢芝勋

中国人兽共患病学报 2014年11期
关键词:基因芯片禽流感亚型

谭 伟,李 孟,谢芝勋

流感大流行严重地危害人们的身体健康、影响人们的日常工作和生活。1918年发生的“西班牙流感”(H1N1亚型)曾造成全球大约四千多万人的死亡,疫情波及到世界上许多国家[1]。此后,还陆续发生过1957年的“亚洲流感”(H2N2亚型)、1968年的“香港流感”(H3N2亚型)及2009年的“墨西哥流感”(H1N1亚型)[1]。

2003-2004年,在香港、荷兰、泰国及越南等国家又分别发现了HPAIV感染人的病例[4]。2013年3月底在我国上海和安徽等一些省份也陆续发生了AIV(H7N9亚型)感染人并引发死亡的病例[5]。虽然目前人们普遍认为AIV通过人传播给人的概率很低,但AIV极易发生变异及近些年来有关AIV感染人的报道呈逐渐增多的趋势,迫切需要政府和防疫部门去更多地关注禽流感的监测、诊断及预防等问题。因此研发快速、特异、灵敏、简便的AIV监测及诊断试剂目前已成为AIV研究的热点问题。

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1 禽流感病毒的特点

AIV的天然宿主包括水禽、野生鸟类和候鸟等[6]。AIV能够通过消化道或呼吸道感染水禽。AIV若传染给人则会造成严重的危害,重者可导致患者呼吸系统功能衰竭、甚至死亡。AIV属于正粘病毒科(Orthomyxovirdae)甲型流感病毒属,是有囊膜的、单股、分节段、负链RNA病毒[1]。AIV含有8个基因片段, 可以编码10个不同的病毒蛋白,包括血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)、基质蛋白(M1、M2)、核蛋白(NP)、非结构蛋白(NS1、NS2)以及RNA聚合酶P蛋白复合体(PB1、PB2、PA)[1]。HA蛋白含有中和抗原决定簇,可以刺激机体产生保护性抗体,而NA蛋白刺激产生中和抗体的能力则稍弱。

A型流感病毒的宿主范围广,既可以感染人,也能够感染其它种属的宿主,如鸡、鸭、鹅、野生鸟类、猪、马、狗、猫、虎、水貂等[7]。季节性流感大多是由A型流感病毒所引起。值得指出的是,目前已知的流感大流行均是由A型流感病毒所造成的。虽然过去关于AIV直接感染人的报道不多,但近些年来有不少这方面的报道[3,5]。根据AIV两个表面蛋白(HA和NA)抗原性的不同,可将AIV分成16个HA亚型(H1-H16)及9个NA亚型(N1-N9)[6]。还可根据病毒基因组序列及地理分布的差异,将AIV分为北美谱系(North American lineage)和欧亚谱系(Eurasian lineage)[8]。

克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇快速检测卡由北京维德康生物技术有限公司生产,国家兽药安全评价中心监制,贵州省兽药饲料监察所提供。快速检测卡需保存在(20±5) ℃的环境中,有效期为12个月,具体生产日期见批号。该种检测卡主要检测猪、牛、羊等动物,可以检测其尿液和屠宰后的酮体。

2 禽流感病毒的传统检测方法

AIV的特异性核酸序列经过常规RT-PCR反应扩增后,通过电泳后观察特异性PCR产物片段的大小来判断是否在检测样本中含有AIV的特定基因片段。由于常规RT-PCR方法的特异性及敏感性较高,且不需要复杂昂贵的实验设备,因此这一方法被广泛用于AIV的检测及诊断。

病毒分离的具体做法是: 采用9~11 d龄无特异性病原体的鸡胚,在其尿囊腔内接种怀疑有AIV的样本,将接种后的鸡胚在35~37 ℃的条件下孵育3~7 d[9]。收集接种24 h后死亡的鸡胚及第7 d未死鸡胚中的尿囊液测定其血凝活性。若血凝试验测定结果为阳性,则说明尿囊液中很可能含有AIV。如果第一代分离物血凝试验结果呈阴性,尿囊液样本再用鸡胚传1~2代,采用相同方法观察鸡胚的发育情况和检测尿囊液中的血凝活性。因为有些检测样本中的病毒含量很低,需要通过鸡胚连续培养来获得高滴度的病毒。

(2)夏季强辐射和高温使得大气的氧化性提高。夏季O3能够显著地影响大气氧化性,强的大气氧化性促进二次颗粒物形成。在冬季,O3对于大气氧化性的贡献不显著,NO2对于大气氧化性的增强有更多的贡献。

母液循环套用时,作为起催化作用的甲醇钠不加或者减少加入量是否对产品的收率有一定的影响?在保持其他反应条件不变的前提下,逐步增加甲醇钠的量,观察收率与含量的变化,如表4所示。

历经风雨之后,方知社会是复杂的,水仙芝不想把它看得更复杂。她想过一种简单的生活,一种纯净、没有污染的生活。读了很多书,她更不相信书,倒相信感觉。

环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由Notomi等人于2000年最先报导的[22]。该反应体系在等温条件下扩增DNA,不用对核酸进行变性和复性,但需要设计4个引物来识别靶DNA序列上的6个不同结合位点。此法能在很短时间内复制模板获得109的扩增产物。后来人们又建立了使用6个简并引物的逆转录-环介导等温扩增法(RT-LAMP)[23]。

2.3AIV的毒力测定 AIV的毒力主要是通过6 w龄鸡体实验的静脉内致病指数(Intravenous pathogenicity index,IVPI)来判定,即若AIV在6 w龄鸡体内的IVPI大于1.2时,则认为被检毒株属于HPAIV[9]。另一常用的判定毒力方法是,当AIV经静脉途径感染4~8 w龄鸡后,若在10 d内引起至少75%的鸡群死亡,则也可以将所测定的AIV毒株划归为HPAIV[9]。研究结果表明,目前所发现的HPAIV大多是H5或H7亚型。尽管仍有不少H5或H7亚型的AIV是LPAIV,可是一旦它们经基因突变或基因重配后就很有可能形成HPAIV,感染新的宿主。

NASBA法的优点在于它在细胞基因组DNA存在的情况下仍能特异性地扩增病毒单链RNA序列。实时荧光NASBA也已被用于检测不同亚型的AIV[10]。由于此法特异、简便易行,不需要PCR反应仪及荧光检测器等设备,因此该方法已成为发展中国家禽流感疫情监测和诊断的重要手段之一。

3 分子生物学手段检测禽流感病毒

应用分子生物学手段检测禽流感病毒是近十多年来的发展趋势[9-10,15,17],其优点是快速、敏感、特异、可靠且便于操作。一旦发现疑似禽流感流行,首先采取的措施是“扑杀政策”以清除传染源。因此建立快速、特异、敏感、便捷的检测AIV的分子生物学手段对监测、控制及预防禽流感意义重大。

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3.1逆转录-聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)可分为一步法和两步法[18]。一步法的优点是快速、简便。病毒RNA分子的转录和PCR反应均在同一个管内进行,从而减少了交叉污染的机会。两步法是先进行病毒RNA的转录,然后再启动PCR反应。由于病毒RNA的逆转录及PCR反应条件分别进行优化,所以两步RT-PCR法要比一步法检测灵敏度更高。同时两步法中得到的病毒互补DNA产物的量足以用于多次检测,便于优化最佳的PCR反应条件及重复实验。而一步法则在每次实验中都会直接消耗病毒RNA模板。因此当临床上得到的病毒RNA样本量很少的情况下,采用两步法似乎更为可取。

2.1病毒分离及血清学检测方法 AIV的鉴别诊断相对比较复杂,一方面是由于AIV的抗原性容易发生改变,另一方面则是因为AIV在其天然宿主中一般不引起严重的病症,即使出现一些临床症状也不典型、不明显。检测AIV的常用方法有病毒分离鉴定和血清中AIV特异性抗体的检测。病毒分离方法特异、敏感、可靠,是检测AIV的“金标准”(Gold Standard)[9]。这一方法能对病毒的生物学性状进行分析,同时增殖大量的病毒也为测定病毒全基因组序列或进行其它检测和生物学特性分析准备了充足的材料。

3.2实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 Spackman等人于2002年首次报道了采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR,RRT-PCR)来检测H5及H7亚型的AIV核酸序列[19]。实时荧光定量RT-PCR不仅需要一对PCR引物来特异性地扩增AIV的基因序列,同时还需要一个用荧光标记的探针来监测PCR产物的扩增状态。此法与常规RT-PCR的最大不同之处在于,它可以监测到每一时刻产物的积聚程度。RRT-PCR的特点是快速,特异性及敏感性也很好,不需要传统的电泳分析步骤,既省时又能对扩增产物做定量分析。但需注意的是应同时测定反应体系中内参基因的表达水平以排除假阴性。

影响RRT-PCR敏感性的因素有很多,例如,抽提得到的病毒RNA的量、纯度以及RNA是否被降解、RNA逆转录反应中引物、PCR反应条件、PCR反应体系中是否存在DNA聚合酶的抑制剂、以及PCR引物和探针的设计等。目前用RRT-PCR来检测AIV已成为世界上许多国家和地区的AIV参考实验室所常规使用的诊断方法之一[15]。多重RRT-PCR可以用于快速检测和区分不同亚型的AIV[20],适合临床样本的检测。

3.3核酸序列依赖性扩增法 核酸序列依赖性扩增法(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)最早是由Kwoh等人报道[21],此法是根据转录及逆转录原理来等温扩增病毒核酸序列[21]。扩增反应需要上游及下游引物,其上游引物的5′末端含有启动子序列,可以被噬菌体T7依赖于DNA的RNA聚合酶所识别。而下游引物的5′末端则含有一段特殊设计的序列,它能与经电化学发光物标记的检测探针互补结合。

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判断H5或H7亚型的LPAIV有无可能成为HPAIV的一个常用标准是:通过序列测定检查病毒HA前体中的蛋白酶裂解位点附近是否含有多个碱性氨基酸。人们发现在HA前体蛋白裂解位点附近,LPAIV大多含有一个精氨酸,而HPAIV则常含有多个碱性氨基酸,除了含精氨酸外还含有赖氨酸[9]。然而值得注意的是例外的情况也时有发生。

3.4环介导等温扩增法

值得注意的是,AIV经过适应后也可以感染其它畜类(像猪、马等)。因此这些被感染的动物亦可以作为AIV的短期中间宿主。根据对鸡或火鸡致病性的不同,可将AIV分为高致病性(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[9]。HPAIV可感染不同组织中的多种细胞引起全身性感染,而LPAIV引起的感染则常局限于呼吸道或消化道。

2.2病毒特异性抗原的检测法 病毒特异性抗原检测法采用的原理主要利用针对AIV特异性抗原的抗体来捕获AIV特异性抗原,例如琼脂扩散试验及酶联免疫吸附试验等[11]。目前已有检测AIV特异性抗原的试剂盒问世[12]。由于AIV的核蛋白(NP)相对保守,不易变异,所以目前采用的病毒抗原捕获免疫测定主要是用来检测AIV的核蛋白。AIV特异性抗原检测法的优点是快速,据报道有些方法可以在30 min之内得到检测结果[13]。目前可以检测AIV N1、N2、N3及N7亚型的抗体的ELISA方法均已建立[14]。但抗原测定法目前存在的主要问题是检测敏感度低于病毒分离法及病毒核酸检测法,同时对所测样品的质量要求较高。检测AIV特异性抗体的试剂盒则可用于评估鸟类或禽类是否曾接触或感染过AIV。

此法快速、简便、易于操作、不需要复杂的仪器设备、且反应可在水浴中完成,因此这一方法用于发展中国家AIV的野外筛查、监测和诊断有着广泛的应用前景。LAMP及RT-LAMP的检测灵敏度受其检测体系中引物的影响。因此应收集和分析新出现的AIV变异株的序列结构,并以此来不断优化RT-LAMP的引物从而提高RT-LAMP法检测AIV流行变异株的敏感性。

3.5基因芯片法 基因芯片法(DNA Microarray)是在20世纪90年代发展起来高通量检测技术[24]。它可以用来同时检测细胞基因组中上万个基因RNA转录体表达的变化。此法采用的基本原理是DNA与其互补序列彼此杂交。基因芯片法包括5个基本操作步骤:基因芯片的制作、样本制备、杂交、检测、数据的采集和分析。简单来说,就是在固状载体表面结合上预先选择设计好的检测捕获探针,然后将待测及对照样本用不同的荧光物进行标记。等比例混合荧光标记产物后再加入基因芯片中使之与不同的检测探针杂交。杂交信号通过荧光激光扫描检测器收集后,再用计算机分析软件对数据进行统计学处理[24]。

基因芯片法可以比较多种基因的表达图谱,用于检测AIV样品中的基因型、基因的缺失、扩增以及基因测序等。FluChip及M基因芯片法已被用来特异性地检测A型流感病毒的不同亚型[25]。据报道采用M基因芯片法,从病人临床样本中提取病毒RNA到完成基因芯片检测只需要不到7个小时的时间[25]。基因芯片法也可用于测定HPAIV或LPAIV感染细胞后宿主基因表达的变化,从而了解AIV的强、弱毒株通过哪些细胞内通路来影响细胞基因的表达。基因芯片法亦可以用来检测AIV基因组的碱基突变。

3.6常规测序及新一代DNA测序方法 DNA测序法最早是分别由Maxam和Gilbert(化学法)以及Sanger(酶法)等人所建立[26-27]。以后Sanger测序法逐渐被世界上许多实验室所广泛采用。传统的、手工操作的Sanger测序法现已发展成为半自动的毛细管电泳法。Sanger法可以直接测定细胞基因组DNA或将感兴趣的DNA片段扩增放大后再测序。一般来讲,Sanger测序法的一个反应可以准确测定约800 bp左右的DNA序列[28-29]。至今Sanger法在AIV亚型及全基因组序列的测定中仍发挥着重要作用。

经鸡胚培养分离出具有血凝活性的AIV后,可以通过血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)来鉴定AIV的亚型。病毒分离法和血清学方法的优点在于它们可以用来准确判断是否发生了AIV的感染。然而它们却难以监测环境中由于突变不断产生的新的AIV变异株[10],这主要是由于人们常常缺乏针对新出现的AIV抗原变异株起特异性反应的血清、抗体及相关的标准诊断试剂。

近年来发展起来的新一代测序方法包括Roche的454基因组测序仪(454 Genome Sequencer),Illumina的基因组分析仪(the Genome Analyzer)以及Applied Biosystems的SOliD系统等[28-29]。这些测序技术的最大特点是高通量检测,一次反应测定出的碱基序列可达gigabase(109)[30]。与常规测序法不同,新一代测序法测定的DNA长度较短,从25~400 bp不等。但新一代测序技术不是简单地测定单一的DNA分子序列,而是同时对高达10万(Roche 454系统)甚至数百万(the Genome Analyzer和SOLiD系统)的DNA分子进行反复多次的测定,因此这种测序方法的精确度很高。

新一代测序法主要用来发现DNA中新突变的碱基,而常规测序法则可用来进一步验证新一代测序法得到的结果。AIV是RNA病毒,只要将其RNA基因经逆转录转变成互补DNA就可以对其基因进行测序。新一代测序法不仅可用于检测多种AIV毒株的亚型,同时还可以测定病毒基因组的全序列[24,28]。基因芯片法和新一代测序法的特点是高通量、快速,自动化程度高,并能精确检测到单个核苷酸的水平。但是基因芯片法在设计检测探针的时候必须事先知道所要测定的细胞或病毒基因组的核苷酸序列,而新一代测序法则没有这个限制。因此在监测新出现的AIV变异株这方面,新一代测序法可能要比基因芯片法有更大的优势。尽管以上两种方法优点明显,但由于需要昂贵的仪器设备及分析软件,所以它们目前在一般的临床检测实验室里还没有被广泛采用。

随着检测技术的更新、发展及检测成本的逐步降低,基因芯片法和新一代测序法很可能会在不远的将来发展成为检测AIV亚型及其全基因组测序的重要手段。

4 结 语

监测AIV的流行变异株有助于流感疫苗株的选用,同时也是监测评估AIV在环境及易感宿主中变化的重要一环。快速检测及诊断AIV在野鸟、家禽及其它种属动物中的流行分布及流行株遗传变异等对控制AIV的传播意义重大。一方面人们应在现有方法的基础上不断改善目前已使用的AIV检测方法,新型检测方法及试剂盒应能准确地区分AIV的16个HA亚型及9个NA亚型, 同时还应能鉴别区分HPAIV与LPAIV。

目前所开展的校企合作还不够深入,不少企业在校企合作培养人才过程中积极性不高,更愿意提供学生实践的场所,不愿意花更多精力参与培养过程。为了提高企业的参与度,有学者认为“政校企”合作应是我国教育发展的新模式,在地方政府部门的支持和引导下,企业与高校密切合作,形成地方政府、高校、企业三方共同参与,建立相互依赖、互利互惠的合作伙伴关系[5]。根据德国校企合作经验,开展深度的校企合作,应建立、健全、完善校企合作的激励机制,充分考虑各种因素,全面激发各参与主体合作的热情,制定一系列科学合理的奖励措施、一揽子行之有效的惩戒举措,充分挖掘产学研合作各方的潜力[6]。

应探索开发新型的分子生物学检测手段,使其在快速检测,亚型鉴别,毒力监测和变异株筛查等方面取得新进展和突破。今后AIV检测方法的研究应朝快速、特异、灵敏、准确、高通量、价廉、便于携带并可用于野外操作的方向来发展。早期检测、快速应对、及时采取适当的防范措施是预防,控制流感大流行的关键。坚持长期监测、对AIV流行变异株做序列相关性分析及流行病学的调查将会为预测禽流感的发生趋势、掌握其变化规律提供有力的科学依据。

参考文献:

[1]Tan W, Xu Q, Xie ZX. Current research on avian influenza virus[J]. Genomics Appl Biol, 2014, 33(1): 194-199.(in Chinese)

谭伟,徐倩,谢芝勋.禽流感病毒研究概述[J].基因组学与应用生物学, 2014, 33(1):194-199.

[2]Kurtz J, Manvell RJ, Banks J. Avian influenza virus isolated from a woman with conjunctivitis[J]. Lancet, 1996, 348: 901-902. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)64783-6

[3]Claas EC, Osterhaus AD, van Beek R, et al. Huamn influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus[J]. Lancet, 1998, 351: 467-471. DOI: 10.1016/S0140-6736(97)11212-0

[4]Capua I, Alexander DJ. Avian influenza: recent developments[J]. Avian Pathol, 2004, 33(4): 393-404. DOI: 10.1080/03079450410001724085

[5]Zhu WF, Gao RB, Wang DY, et al. A review of H7 subtype avian influenza virus[J]. Chin J Virol, 2013, 29: 245-249. (in Chinese)

朱闻斐,高荣保,王大燕,等. H7亚型禽流感病毒概述[J].病毒学报,2013,29:245-249.

[6]Munster VJ, Fouchier RA.Avian influenza virus: of virus and bird ecology[J].Vaccine, 2009, 27(45): 6340-6344. DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.02.082

[7]Olsen B, Munster VJ, Wallensten A, et al. Global patterns of influenza a virus in wild birds[J]. Science, 2006, 312: 384-388. DOI: 10.1126/science.1122438

[8]Donis RO, Bean WJ, Kawaoka Y, et al. Distinct lineages of influenza virus H4 hemagglutinin genes in different regions of the world[J]. Virology, 1989, 169: 408-417. DOI: 10.1016/0042-6822(89)90166-9

[9]Alexander DJ. Avian influenza-diagnosis[J]. Zoonoses Public Health, 2008, 55: 16-23. DOI: 10.1111/j.1863-2378.2007.01082.x

[10]Sakurai A, Shibasak IF. Updated values for molecular diagnosis for highly pathogenic avian influenza virus[J]. Viruses, 2012, 4(8): 1235-1257. DOI: 10.3390/v4081235

[11]Charlton B, Crossley B, Hietala S. Conventional and future diagnostics for avian influenza[J]. Comparat Immunol Microbiol Infect Dis, 2009, 32: 341-350. DOI: 10.1016/j.cimid.2008.01.009

[12]Davison S, Ziegler AF, Eckroade RJ. Comparison of an antigen-capture enzyme immunoassay with virus isolation for avian influenza from field samples[J]. Avian Dis, 1998, 42: 791-795. DOI: 10.2307/1592717

[13]David L, Suarez DL, Das A, et al. Review of rapid molecular diagnostic tools for avian influenza virus[J]. Avian Dis, 2007, 51: 201-208. DOI: 10.1637/7732-101006-REGR.1

[14]Suarez DL. DIVA vaccination strategies for avian influenza virus[J]. Avian Dis, 2012, 56(4 Suppl): 836-844. DOI: 10.1637/10207-041512-Review.1

[15]Pasick J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections[J]. Transbound Emerg Dis, 2008, 55: 329-338. DOI: 10.1111/j.1865-1682.2008.01047.x

[16]Hatta M, Gao P, Halfmann P, et al. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses[J]. Science, 2001, 293: 1840-1842. DOI: 10.1126/science.1062882

[17]Yu H, Cai JL. Progress in detection methods of avian influenza viruses[J]. Progr Vet Med, 2009, 30(12): 78-81. (in Chinese)

余华,蔡家利.禽流感病毒检测方法研究进展[J].动物医学进展, 2009,30(12):78-81.

[18]Wang R, Taubenberger JK. Methods for molecular surveillance of influenza[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2010, 8(5): 517-527.DOI: 10.1586/eri.10.24

[19]Spackman E, Senne DA, Myers TJ, et al. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 haemagglutinin subtypes[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40: 3256-3260. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3256-3260.2002

[20]Spackman E, Senne DA, Bulaga LL, et al. Development of multiplex real-time RT-PCR as a diagnostic tool for avian influenza[J]. Avian Dis, 2003, 47: 1087-1090. DOI: 10.1637/0005-2086-47.s3.1087

[21]Kwoh DY, Davis GR, Whitefield KM, et al. Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format[J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 1989, 86: 1173-1177. DOI: 10.1073/pnas.86.4.1173

[22]Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucl Acids Res, 2000, 28: e63. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63

[23]Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Development of H5-RT-LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection[J]. Vaccine, 2006, 24: 6679-6682. DOI: 10.1016/j.vaccine.2006.05.046

[24]Schena M, Shalon D, Davis RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J]. Science, 1995, 270: 467-470. DOI: 10.1126/science.270.5235.467

[25]Dawson ED, Moore CL, Smagala JA, et al. MChip: a tool for influenza surveillance[J]. Analytical Chem, 2006, 78: 7610-7615. DOI: 10.1021/ac061739f

[26]Maxam AM, Gilbert W. A new method for sequencing DNA[J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 1977, 74: 560-564. DOI: 10.1073/pnas.74.2.560

[27]Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 1977, 74(12): 5463-5467. DOI: 10.1073/pnas.74.12.5463

[28]Schweiger MR, Kerick M, Timmermann B, et al. The power of NGS technologies to delineate the genome organization in cancer: from mutations to structural variations and epigenetic alterations[J]. Cancer Metastasis Rev, 2011, 30: 199-210. DOI: 10.1007/s10555-011-9278-z

[29]Graveley BR. Molecular biology: Power sequencing[J]. Nature, 2008, 453: 1197-1198.DOI: 10.1038/ 4531197b

[30]Wold B, Myers RM. Sequence census methods for functional genomics[J]. Nat Methods, 2008, 5: 19-21.DOI: 10.1038/nmeth1157

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