重复序列突变与神经退行性疾病

宿俊杰， 靳 玫， 刘晓利， 唐超智， 贾盼盼综述， 王文晟审校

核苷酸重复序列普遍存在于真核生物基因组。在染色体上经常出现一些重复序列，如(CCG)n、(CCTG)n等。相比一般DNA序列，这些重复序列更不稳定。其拷贝数易增加或减少，导致重复序列扩展或缩减［1，2］。重复序列在DNA复制、转录、修复等过程中易形成二级结构，这些结构导致重复序列的变异，进而导致人类神经退行性疾病。神经退行性疾病(neurodegenerative disease，NDDs)是一种以大脑和脊髓细胞神经元丧失的为特征的疾病。随着人口老龄化的发展，NDDs将超过癌症，成为继心血管疾病之后的第二大死亡原因。在神经退行性疾病中，有约40种是由重复序列的突变引起的。本文对重复序列不稳定的特征、机制及其与NNDs的相关性进行综述。

1 与重复序列突变相关的神经性退行疾病

重复序列突变是一种独特的变异，它和近40种神经退行性疾病相关。不像其他变异，重复序列的变异是动态的。引起各种NNDs的重复序列的类型、相关基因及位置等。

2 重复序列突变的机制

正确理解引发疾病的重复序列变异的机制对开辟新的治疗途径和研发新药物至关重要。由于重复序列的特殊性，易形成非正常DNA二级结构。正常情况下，这些非正常的二级结构在DNA代谢过程中被清除掉，然而当清除过程异常时，就引起重复序列突变［1，2］。

2.1 重复序列的结构 重复序列易形成的非正常二级结构的特性与其对称性，序列组成，超螺旋等方面的因素是密切相关的。虽然这些二级结构在细胞内无法探知，但在体外的实验中许多已被证实。如(CCTG)n·(CAGG)n折叠形成发卡结构，(CCG)n·(CGG)n和(CGCG4CG4)n能折叠成G四链结构，(CTG)n·(CAG)n能形成“十字”结构，(GAA)n·(TTC)n在负超螺旋影响下能形成H-DNA。这些异常的DNA二级结构严重影响DNA复制、修复、同源重组及转录等过程［3］。下面就重复序列形成的二级结构导致重复序列的不稳定机制进行解释。

2.2 重复序列突变形成的分子机制 对于重复序列是如何在DNA代谢过程中产生扩增或缩减的，有以下几种机制。

2.2.1 DNA复制机制 在对酵母等的研究中发现许多参与DNA复制，特别是与冈崎片断成熟过程中有关的蛋白质发生变异时引发急剧升高的重复序列的不稳定。DNA复制模型又包括两种假说。第一种是Harvey于1997年提出的“链滑动”假说［4］。该假说认为，DNA复制过程中，含有不稳定重复序列的DNA单链作为模板合成新链时，会由于链的滑动作用造成碱基错配，若错配引起新生链上形成泡状或者发夹等结构，该新生链作为模板链在下一轮复制时就会造成重复序列的扩增或缩减。近年，Mirkin提出在滞后链合成过程中复制叉的暂停与重新启动假说，即在滞后链模板中，由重复序列形成的异常二级结构会拖延滞后链的合成，破坏其与前导链合成的协调性［3］。该模型可以在分子水平上解释一些重复序列扩展的遗传特征。

2.2.2 DNA修复机制 许多DNA修复包含了部分DNA复制的过程，像FEN1、PCNA等DNA复制的蛋白质同样也参与了DNA修复，因而在修复过程中，重复序列的DNA同样会形成滑动链的结构。另外，非有丝分裂的组织(如脑组织)或DNA修复缺陷的组织同样出现大量的重复序列突变现象。因此DNA修复同样也与稳定重复序列突变发生的过程有关。根据DNA修复的类型，造成重复序列的不稳定的原因可以从以下4个方面进行阐述。(1)错配修复:在转基因老鼠中，CAG/CTG的扩展离不开错配修复蛋白质MSH2、MSH3和PMS2的功能。MSH2的变异导致重复序列的扩展停止。而MSH3的失活使CTG/CAG重复序列发生缩减，这为 CTG/CAG 疾病的治疗提供了新思路［5～7］。(2)碱基切除修复(BER):研究发现HD和FXS小鼠氧化促进三核酸重复序列的扩展，双氧水处理可诱导人的HD细胞的重复序列扩展，这些结果暗示重复序列的扩展是在碱基切除修复(BER)这一过程中产生的，另外，失去氧化碱基切除修复酶-8-鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)功能的小鼠抑制重复序列扩展的发生的事实也支持了这一观点［8，9］。在去除氧化碱基后，BER是通过部分DNA合成完成的。这一过程和冈崎片断的成熟类似，产生的含重复序列的单链Flap会形成发卡和环状中间物阻止FEN1切除重复的Flap，导致 DNA的扩展［10］。(3)核酸切除修复(NER):NER包括两条途径:转录耦合修复和全球基因组修复。ERCC1-XPF复合物切断先于XPG，含有重复序列的单链DNA形成发卡或环状的Flap，阻止了XPG的切除，导致重复序列突变［2］。在不同的研究中，CAG重复序列倾向于缩减。在人的细胞中，基因敲除NER的蛋白质ERCC1，XPG和CSB时CAG重复序列的缩减程度降低［11］。(4)双键断裂修复(DSBR):研究表明双键断裂和重复序列相关的复制异常有关。复制中产生的链滑动和复制叉暂停会产生双键断裂，最终通过基因交换和单链DNA结合来修复。具体将在DNA重组模型中加以阐述。

目前，DNA几种修复途径之间的交联与寡核苷酸重复扩展之间的关系越来越引起人们的关注，并且，现在有证据倾向于认为混合途径更为重要的［12］。比如MSH2-MSH6、BER糖基化酶和MUTYH形成结构复合体，以及上述的MSH2-MSH3和OGG1之间的关系来解释BER和MMR与寡核苷酸重复序列长度变化的关系。

2.3 DNA重组机制 基因重组也参与了重复序列突变的发生过程。最简单的一种机制是减数分裂过程中同源染色体上的重复运行之间的不平等交换导致扩展和缩减。重组修复模式认为DNA重组和DNA合成过程联合，可以导致三核苷酸重复序列突变扩展。研究发现，重复序列扩展可促进自身不平等的姐妹染色单体交换，并且基因转换期间经历了频繁的扩展［13］。另一种机制是在DNA修复过程中形成的单链DNA入侵双链中的同源序列引起重复序列扩展。在滞后链模板中，通过一个可扩展的重复导致复制叉的拖延而形成一个稳定的二级结构，由真核细胞内切酶切割和加工这种结构，这个内切酶和细菌核酸酶SbcCD功能同源，会产生一个3’端重复序列扩展的单链DNA片段，能侵入姊妹染色单体，导致重复序列扩展［3］。

3 重复序列突变导致NDDs的机制

3.1 疾病相关基因功能的改变 重复序列扩展导致的突变发生在编码区时，比如由多谷氨酰胺残基polyQ片段介导的多聚谷氨酰胺病中，编码蛋白的谷氨酰胺链延长，导致该蛋白在细胞内累积，对神经元产生了某种毒性。目前已经证明，polyQ长度的增加对细胞核具有毒性，是导致疾病发生的一个重要因素［14］。此外，异常扩展的polyQ突变蛋白可能与一种或几种神经元中大量表达的易损伤的蛋白发生相互作用，导致选择性神经元核内包涵体的形成和神经元变性。近年的研究发现，大量表达于SCA1患者Purkinje细胞和其它脑区的富含亮氨酸的酸性核蛋白就是一种在损伤的神经元中大量表达的蛋白［15］。再者，在HD和SCA1转基因鼠模型以及HD患者的神经元中均发现含有扩增的polyQ的细胞核内包涵体［16］，由此推测这些核内包涵体可导致神经性失调或功能障碍。

3.2 异常RNA的产生 DM、FRAXA和FRAXE等疾病的三核苷酸重复扩展位于其致病基因的非翻译区。在DM2中，其(CCTG)n扩增的重复片段被转录为RNA后，突变的RNA会滞留在核内，干扰肌核的正常功能，对肌纤维产生毒性［17］。其它可能有类似病理机制的疾病还有SCA8、SCA10、SCA12以及HDL2。

3.3 基因功能的丢失 通过阻断或阻碍基因转录导致基因功能的丢失也会导致NNDs。比如，进行性肌阵挛癫痫(EPM1)是由于半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(cystatin B)基因转录起始点上游启动子中的重复序列(C4GC4GCG)n发生扩展，阻断转录因子，导致转录功能丧失而引起的。

3.4 表观遗传学修饰 研究发现，SCA2致病基因ATXN2启动子区域CpG的DNA甲基化水平与患者(CAG)n的扩展有关［18］。另外，FRDA患者致病基因fxn位点的核小体核心组蛋白H3的第9位赖氨酸残基大多处于甲基化修饰状态，说明FRDA患者细胞内FXN蛋白的编码基因所在的染色质部位是处于抑制状态，这样的染色质状态可能影响转录的延伸［19］。在细胞核内，组蛋白乙酰化与去乙酰化过程处于动态平衡，Debacker等发现特殊的HDAC在出芽酵母和人类星形胶质细胞中均能促进(CTG)n的扩增［20］。

4 总结与展望

过去的研究对重复序列突变的机制的理解已有很大提高。给由此引起的神经性退行疾病的治疗带来了希望。如抑制MSH3的活性可使重复序列缩减同时不造成整个染色体的不稳定和发癌的现象。本研究小组发现利用解旋酶，可消除DNA复制或修复中重复序列产生的发卡或泡状结构等二级结构，阻止重复序列的扩展。通过特定目标假尿苷化实现翻译终止。使扩展的重复序列在翻译时提前中止，产生正常的产物。研究同时也显示出重复序列突变的复杂性。部分原因在于重复序列的突变不是单一机制完成的，而是多种DNA代谢过程叠加的结果。另外变异的发生对于不同的阶段，组织和细胞而言是独特的。只有把隐藏的由重复序列突变引起的神经退化性疾病的致病机制逐步理清，才能针对神经退化性疾病加以有效的预防、早期诊断和治疗。因此从基础研究到开发出对重复序列变异引发的神经性退行疾病有效的发治疗方法还有相当的路要走。

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