α-硫辛酸对电点燃致痫大鼠行为学及海马p38MAPK表达的影响

房海波， 王维平， 王洪超， 臧红敏， 甄军丽， 马彩云， 王 伟

癫痫(Epilepsy)是一种常见的、慢性反复发作的神经系统综合征，可导致严重的神经元凋亡或坏死，从而影响患者的认知功能和社会生活，并给家庭和社会带来沉重的负担。因此，深入研究癫痫发作后神经元凋亡的分子机制，探索有效的抗凋亡药物具有重要的意义。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员之一，当受到各种应激刺激时p38MAPK被激活，进而通过多条信号转导通路引起神经元凋亡。α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)是一种强效的天然抗氧化剂，在神经变性疾病、缺血再灌注损伤、多发性神经病等疾病中发挥显著的抗氧化作用。然而，其在癫痫和凋亡方面的研究还很少。本实验应用α-LA对杏仁核电点燃大鼠进行干预，通过观察大鼠行为学表现，检测海马p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达水平及海马神经元凋亡率，从而初步探讨α-LA发挥神经保护的效果及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 电极植入过程及检测 点燃前后发放阈值(afterdischarge threshold，ADT)大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，刺激电极插入左侧杏仁核(前囟后 2.8 mm，左旁开 4.8 mm，颅骨下 8.6 mm)，脑电图描记电极、参考电极和接地电极分别插入右额部、左、右侧顶枕交界区，插入深度为颅骨下接近硬脑膜即可，牙托树脂和502胶水固定，恢复1 w，检测点燃前ADT(刺激参数为:单向方波脉冲，脉冲持续时间1.0 ms，频率 60 Hz，串持续时间为 1.0 s。刺激电流强度从100 uA开始，每隔5 min增加40 uA直至脑电图上出现至少持续3 s的后放电为止。刺激电流强度超过700 uA仍未出现后发放的大鼠将被剔除)。

1.2 动物分组及模型制备 雄性Wistar大鼠36只，由河北医科大学实验动物中心提供，起始体重280±20 g，SPF级。随机分为以下6组，每组6只。正常对照组:不给予任何处理;α-LA组:每天给予α-LA(40 mg/kg)(德国史达德大药厂)腹腔注射一次;假手术组:杏仁核植入电极后不给予任何处理;电刺激模型组(ES组):植入电极后每天以120%的点燃前ADT刺激一次;电刺激+α-LA低剂量组(电低α-LA组):植入电极后每天给予α-LA(20 mg/kg)腹腔注射30 min后以120%的点燃前ADT刺激一次;电刺激+α-LA高剂量组(电高α-LA组):植入电极后每天给予α-LA(40 mg/kg)腹腔注射30 min后以120%的点燃前ADT刺激一次，连续刺激15 d。依据Racine评价标准观察大鼠的行为学表现，记录每只大鼠第一次达到每个发作等级所需的累积刺激数及累积后发放持续时间(duration of afterdischarges，ADD)。最后一次刺激结束后按检测点燃前ADT的方法检测ES组、电低α-LA组和电高α-LA组的点燃后ADT。

1.3 Western blot检测海马 p38MAPK及 pp38MAPK的表达水平 模型制备完成后，每组6只大鼠均采用断头取脑并快速分离海马，提取总蛋白，测蛋白浓度，取50μg蛋白95℃ ～98℃变性5 min，以非连续Tris-SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转到硝酸纤维素膜上。脱脂奶粉室温封闭1 h，兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗体(1:300，美国Bioworld公司)、兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗体(1:300，美国Bioworld公司)4℃过夜，漂洗5次，山羊抗兔IgG荧光抗体(1:4000，Rockland公司)室温避光1 h，漂洗5次，远红外荧光扫描成像系统(Odyssey公司)扫描并测定目标蛋白单位光密度值，与GAPDH(1:400，美国Bioworld公司)比值后，做统计学分析。

1.4 碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色检测海马神经元凋亡率 海马组织置放于70% 乙醇中4℃保存24 h，将组织置于180目钢丝滤网上，剪碎组织后用小镊子轻轻搓组织，边搓边用生理盐水冲洗，将冲洗液转移到塑料试管内，过滤冲洗液一次，4℃，1000 rpm，离心4 min，留取沉淀，加入500 μl PI染液，4℃冰箱静置30 min后检测。

1.5 统计学分析 实验结果用均数±标准差(χ±s)表示，运用Spss13.0软件进行处理，采用完全随机设计资料方差分析和配对t检验进行显著性差异分析，运用SNK法检验进行组间比较。

2 结果

2.1 行为学检测结果 (1)与ES组相比，电高α-LA组达到第一次Ⅴ级发作所需的累积刺激数明显增多(P＜0.05)，点燃后 ADT明显增高(P＜0.05)。ES组、电低α-LA组和电高α-LA组达到第一次Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级发作所需的累积刺激数之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。(2)与ES组相比，电低α-LA组和电高α-LA组达到第一次Ⅴ级发作所需的累积ADD明显缩短(P＜0.05)。ES组、电低α-LA组和电高α-LA组达到第一次Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级发作所需的累积ADD之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。(3)ES组、电低α-LA组和电高α-LA组点燃后ADT较点燃前ADT明显降低(P＜0.05)。

2.2 Western Blot结果 各组之间 p38MAPK表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05)。电低α-LA 组(2.20 ±0.04)和电高 α-LA 组(1.26 ±0.93)的 p-p38MAPK表达水平较 ES组(3.39±0.09)明显降低(P＜0.05);并且电低 α-LA组的海马p-p38MAPK表达水平明显高于电高α-LA组(P＜0.05)。ES组、电低α-LA组和电高α-LA组海马p-p38MAPK表达水平明显高于正常对照组(0.62±0.05)、α-LA 组(0.64 ±0.05)和假手术组(0.56 ±0.06)(P ＜0.05)。

2.3 细胞凋亡率检测结果 电低 α-LA组(11.71 ±0.52)和电高 α-LA 组 (8.65 ±0.38)的海马神经元凋亡率较ES组(14.83±0.60)明显降低(P＜0.05);并且电低α-LA组海马神经元凋亡率明显高于电高α-LA组(P＜0.05)。ES组、电低α-LA组和电高α-LA组的海马神经元凋亡率明显高于正常对照组 (1.72 ±0.46)、α-LA 组 (1.53 ±0.37)和假手术组(1.91 ±0.60)(P ＜0.05)。

3 讨论

癫痫发作可致脑部神经元凋亡，海马等边缘系统的神经元凋亡尤为明显［1］。神经元凋亡可导致神经胶质细胞增生、苔藓纤维出芽及海马硬化，进而促进癫痫发展。癫痫动物模型具有与人类癫痫相似的行为和脑电图特征，电点燃是目前普遍采用的动物模型制备方法，该模型具有如下优点:(1)一旦建立，脑内兴奋性神经元可保持数月;(2)在发作行为、痫样放电扩散及脑电图等方面与人类癫痫相似;(3)电极位置可由实验者自由选择，以便控制癫痫灶的位置;(4)发作时间容易控制，重复性好;(5)动物对刺激反应性好，死亡率低。因此，本实验采用杏仁核电点燃方法制备慢性癫痫大鼠模型。

α-硫辛酸(α-LA)是天然抗氧化剂中作用最强的一种，也是存在于多种酶复合物中的天然辅因子［2］。在许多类型细胞中，α-LA对活性氧簇诱导的凋亡具有保护作用。α-LA既具有水溶性又具有脂溶性，这一重要的特性使得它能够顺利通过血脑屏障从而保护脑内的神经元［3］。已有研究表明，α-LA能够通过降低兴奋性氨基酸水平并提高抑制性氨基酸水平来发挥癫痫后的神经元保护作用［4］。本实验结果表明，与ES组相比，应用α-LA干预后癫痫发作等级降低，达到相同发作等级所需的累积刺激数增加、累积ADD缩短，点燃后的ADT增高，其原因可能为α-LA能够减少癫痫发作后神经元的凋亡数量，从而降低大鼠对电刺激的敏感性，故达到相同的发作等级需要更多的电刺激数。同时受到相同强度的刺激后，比ES组大鼠更难于发作，故点燃后的发放阈值增高。由于α-LA干预的大鼠每次的ADD都比ES组短，因此达到相同的发作等级所需的累积ADD也比ES组缩短。

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员之一，其催化域内的VII和VIII子域之间具有苏氨酸-甘氨酸-酪氨酸(TXY)双重磷酸化结构域［5］。通常情况下，p38MAPK按下列方式次序激活:MAPKKK-MAPKK-p38MAPK［6］，MKK3 和 MKK6是激活p38MAPK的两种相对特异性的丝裂原活化蛋白激酶激酶［7］。此外，p38MAPK还能够通过非依赖 MAPKK的机制发生自动磷酸化［8］。通常，p38MAPK以无活性的形式存在于细胞质内，当被激活后转化为具有活性的磷酸化形式［9］。研究表明，神经生长因子剥夺及Fas结扎诱导的细胞凋亡中都存在P38MAPK的激活［10］，P38MAPK的特异性抑制剂SB203580能够抑制水杨酸钠诱导的FS-4纤维母细胞凋亡［11］及谷氨酸盐诱导的小脑颗粒细胞凋亡［12］。由此表明，p38MAPK与凋亡之间存在着密切关系。在凋亡反应中p38MAPK通路的功能即可以是caspase的上游也可以是其下游。此外，p38MAPK还可以通过激活p53、促进氧自由基和弹性蛋白酶的释放、上调TNFα的活性等方式参与调节细胞凋亡。本研究发现，癫痫发作后海马组织内p-p38MAPK蛋白表达水平明显上调且海马神经元凋亡率明显增加，应用α-LA干预后能剂量依赖性地降低海马组织内p-p38MAPK蛋白表达水平和海马神经元凋亡率。

总之，根据上述的实验研究结果，我们推测α-LA对癫痫大鼠的海马神经元具有保护作用，可能与其下调p-p38MAPK蛋白的活性有关。

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