姜黄素通过清除小胶质细胞内活性氧类物质保护多巴胺能细胞

崔群力， 李岩琦

既往对帕金森病的研究多是从多巴胺能神经元的角度来探索PD的发病机制，自从在PD患者脑和动物模型中发现黑质致密部除了有大量DA能神经元缺失外，还有胶质细胞的大量增生［1］，免疫炎症反应在PD发病中的作用被日益受到重视［2］。炎症反应在脑中的标志是脑中的固有细胞-小胶质细胞的激活［3］。抑制小胶质细胞过度激活和炎症反应过程可能代表了在PD中减少神经元变性的一个治疗方向。

姜黄素是食用香料姜黄的主要成分，具有抗氧化［4］、抗炎作用，能够调节和抑制小胶质细胞的表达和迁移［5］。为此，我们采用神经生长因子诱导过的PC12细胞作为细胞模型，以鱼藤酮作用于BV-2细胞后，以含有炎性细胞因子的条件培养液处理PC12细胞，观察PC12细胞的存活率及凋亡现象，探讨小胶质细胞激活后对多巴胺能神经细胞的影响，研究姜黄素抑制小胶质细胞激活及保护多巴胺能细胞的机制。

1 材料和方法

1.1 试剂 姜黄素、鱼藤酮购自美国Sigma公司;其余试剂为国产分析纯。姜黄素于DMSO中配成20 mmol/L储液，-20℃储存，用时以完全培养基稀释成工作液;鱼藤酮于DMSO中配成1 mmol/L储液，-20℃储存，用时用完全培养基稀释成工作液。

1.2 细胞培养

1.2.1 PC12细胞培养在高糖DMEM培养基中，内含10%胎牛血清。在通有5%CO2的37℃的培养箱中培养，隔天换液一次。细胞丰度达70% ～80%时传代一次，并于细胞丰度达70% ～80%时进行试验，每次实验前更换含10%胎牛血清DMEM培养基培养48 h。BV-2细胞培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在体积分数为5%CO2的37℃的培养箱中培养，隔天换液一次，细胞丰度达70%～80%时传代一次，并于试验前更换培养基。

1.2.2 条件培养液处理PC12细胞 姜黄素预处理BV-2细胞4 h加入所需终浓度的鱼藤酮共孵育6 h，收集培养上清，作为PC12细胞的条件培养液(microglia conditioned medium with curcumin，MCMC)。实验前更换PC12细胞的培养基，将条件培养液加入PC12细胞继续培养。在细胞培养后的24 h观察细胞存活率及凋亡。

1.2.3 分组和药物处理 取鱼藤酮和姜黄素母液，按适当比例用完全培养基稀释成工作液，DMSO的含量小于0.1%。鱼藤酮组药物终浓度分别为:5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、0.5 μmol/L 和1.0 μmol/L，孵育时间为 24 h。姜黄素药物终浓度分别为 0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L。姜黄素预处理4 h后按要求加鱼藤酮至所需终浓度(部分检测指标只涉及姜黄素 0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L;鱼藤酮10 nmol/L)。另设姜黄素组(只加姜黄素)及无药物处理组。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力将对数生长期细胞离心、收集，将细胞沉淀重悬于培养基中，将成团细胞反复吹打制成单细胞悬液，计数并调整至适当的细胞浓度1×108-9/L，按1×104-5个细胞/孔接种(每孔加细胞悬液90μl)于96孔培养板，每组6个复孔。另设调零孔不接种细胞，只加培养基，其他条件相同。姜黄素药物终浓度分别为0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L;鱼藤酮组分别加入适量的鱼藤酮稀释液(每孔10μl)，使其终浓度分别为 5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L 和 10 μmol/L;姜黄素预处组姜黄素药物终浓度分别为0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，4 h 后按要求加鱼藤酮至所需终浓度(10 nmol/L)共孵育6 h，对照组不加任何药物(每孔终体积100μl)。孵育24 h后每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)，37℃继续孵育4 h，加入100μl DMSO，振荡10 min至甲月赞颗粒充分溶解，在570 nm波长下用酶标仪测定各孔OD值。

1.3.2 苏木素、伊红染色观察BV-2细胞形态学改变 将消毒好的多聚赖氨酸包被的盖玻片置于六孔板中，然后接种适当浓度的BV-2细胞。待细胞贴壁后，加入姜黄素使其终浓度为0.5μmol/L、1 μmol/L、5μmol/L，预处理4 h后，加入鱼藤酮至终浓度为10 nmol/L，同时设鱼藤酮组和空白对照组，置37℃5%、CO2细胞培养箱培养24 h;弃去培养液，取出盖玻片，自来水冲洗。4%多聚甲醛固定30 min;苏木素染色10 min，自来水冲洗多余染液，1%盐酸乙醇分化数秒钟，自来水冲洗;1%氨水(Scotte氏液)中返蓝数秒钟，自来水冲洗;1%伊红乙醇染色3 min，自来水冲洗;自然风干后，中性树胶封片，光镜下观察摄像。

1.3.3 DCGH-DA染色法检测BV-2细胞内活性氧类物质(ROS)水平 DCFH-DA(2’-7’-二氯荧光乙酰乙酸盐)是一种能自由通过细胞膜的染色剂，其本身不发出荧光，当被细胞内ROS氧化为荧光化合物DCF时便发出荧光。通过检测DCF的荧光强度，反映细胞内ROS的水平。分组及药物处理:姜黄素预处理组(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)4 组;鱼藤酮组;空白对照组，共6组。按要求加入姜黄素使其终浓度为0.5μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，预处理 4 h 后，加入鱼藤酮终浓度为10 nmol/L，空白对照组不加任何药物培养基培养，置37℃ 5%、CO2细胞培养箱培养24 h。按照试剂盒说明书进行操作。小心抽去细胞培养液体并收集细胞。进行流式细胞仪检测:波长488 nm氩离子激光，观察50000个以上细胞，波峰右移表明活性氧(ROS)含量高。

1.3.4 annexin V-FITC/PI双染法，流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡。

1.3.4.1 检测原理 磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)正常情况下位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。annexin V与PS有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此，用annexinV与PI双染色，可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

1.3.4.2 操作步骤

1.3.4.2.1 分组及药物处理 姜黄素预处理组(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)4组;鱼藤酮组;空白对照组，共6组。按要求于BV-2细胞培养瓶内加入姜黄素使其终浓度为0.5μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，预处理 4 h 后，加入鱼藤酮至终浓度为10 nmol/L，空白对照组不加任何药物培养基培养，置37℃ 5%、CO2细胞培养箱培养6 h;然后搜集培养液作为PC12细胞的条件培养液(MCMC)，将条件培养液加入到相应组PC12细胞培养瓶继续培养48 h。

1.3.4.2.2 各组细胞按要求处理后 离心收集细胞，PBS洗涤2次，收集约1×105个细胞。加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5μl annexin V-FITC混匀后，加入 5μl PI，混匀;室温、避光、反应5～15 min;1 h内进行流式细胞仪检测(激发波长:488 nm;发射波长:530 nm)。

1.3.4.2.3 结果判断 在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(annexin V-/PI-);右下象限为早期凋亡细胞，显现(annexin V+/PI-);右上象限是晚期凋亡细胞，为(annexin V+/PI+);而左上象限显示坏死细胞，为(annexin V-/PI+)。

1.4 统计学处理 检测结果采用均数±标准差(χ±s)表示，全部数据由SPSS13.0软件进行统计学分析，多组数据间的显著性分析采用单因素方差分析，两组数据间的显著性分析采用t检验。

2 结果

2.1 MTT检测细胞增殖活力 条件培养液对PC12细胞增殖活力的影响:姜黄素在低浓度(0.5 μmol/L～10μmol/L)时对 PC12细胞及BV-2细胞活力无明显影响;鱼藤酮(10 nmol/L)对PC12细胞及BV-2细胞活力无明显影响(资料未提供)。所以，我们选用姜黄素浓度(0.5μmol/L～10μmol/L)和鱼藤酮(10 nmol/L)进行随后的实验。对照组、鱼藤酮(10 nmol/L)组、姜黄素预处理组(姜黄素药物终浓度分别为 0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，预处理4 h后，与终浓度10 nmol/L的鱼藤酮共孵育BV-2细胞6 h，收集培养液作为PC12细胞的条件培养液)共6组。结果显示:鱼藤酮组与对照组比较，PC12细胞活力显著降低(P＜0.01);姜黄素预处理的条件培养液使PC12细胞活力增加，与鱼藤酮组比较有显著统计学差异(P＜0.05)。

2.2 姜黄素对鱼藤酮致敏BV-2细胞形态学改变的影响 空白对照组:BV-2细胞突起明显，成双极状;鱼藤酮组:BV-2细胞激活，大多呈阿米巴样;各姜黄素干预组:BV-2细胞形态有所恢复，以1.0μmol/L姜黄素干预组细胞形态恢复最明显。

2.3 DCGH-DA染色法检测BV-2细胞内活性氧类物质(ROS)水平 以DCFH-DA荧光强度反映ROS水平，空白对照组细胞的ROS水平为100±9.39%。应用鱼藤酮10 nmol/L处理24 h后，可使细胞内产生大量的活性氧，荧光强度增加，细胞ROS水平升至对照组的187.9±20.5%，差异有极显著统计学意义(P＜0.01)。分别给予0.5μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L 姜黄素预处理4 h后和10 nmol/L鱼藤酮共同孵育24 h，可拮抗ROS的生成，荧光强度明显降低，其中1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黄素的抑制作用最强。上述各浓度姜黄素预处理组的细胞ROS水平分别为空白对照组的 167.9 ± 18.5%、142.9 ± 15.1%、137.1 ±17.6%和151.0±16.8%。0.5 μmol/L 姜黄素组与鱼藤酮组比较差异有显著统计学意义(P＜0.05);1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L 姜黄素组与鱼藤酮组比较差异有极显著统计学意义(P＜0.01)。

2.4 annexin V-FITC/PI双染法，流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡 对照组、鱼藤酮(10 nmol/L)、姜黄素预处理组(姜黄素药物终浓度分别为0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，预处理4 h后，与鱼藤酮终浓度10 nmol/L共孵育BV-细胞6 h)共6组。收集以上各组培养液作为PC12细胞的条件培养液，继续培养24 h。

流式图显示:空白对照组的细胞凋亡率为3.6±1.4%;鱼藤酮处理组，细胞凋亡率升至41.3±5.1%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L各姜黄素条件培养液组PC12细胞凋亡率分别为:34.6 ± 2.8%、21.6 ± 3.0%、26.7 ± 4.1%、32.8 ±1.9%，与鱼藤酮组比较有统计学差异(P＜0.05)。

3 讨论

PD是一种神经变性疾病，以中脑黑质多巴胺能神经元进行性丢失为特征，并且多巴胺能神经元的丢失在PD症状出现前多年就已经开始。近年来，越来越多的研究认为炎症反应是神经系统变性疾病共有的重要特征［6］。在炎症反应过程中，小胶质细胞被认为是关键的因素。

小胶质细胞是脑中的固有细胞，在海马、基底节和中脑小胶质细胞密度最高［7］，在中脑这个区域也是PD多巴胺能神经元受损最严重的区域。研究证明:小胶质细胞受到某些因素的刺激激活介导的炎症反应增加了外源性刺激或毒素对神经元的破坏。小胶质细胞无控制的激活导致了神经变性疾病的慢性进展，是PD进行性发展的驱动力［8］。在无小胶质细胞存在时，MPTP诱导的急性神经毒性是非进展性的;而在小胶质细胞存在时，MPTP诱导了很强的、进展性的多巴胺能神经元变性［9］。而且，药物抑制小胶质细胞激活或者敲除编码各种炎症介质的基因可以抑制MPTP或LPS诱导的多巴胺能神经元的进行性损害［10］。总之，过度的炎症反应，无论是作为起始因素还是继发反应都促发了神经变性疾病慢性、进展性的过程。

因此，抑制小胶质细胞介导的炎症反应，阻断炎症反应介导的对神经元损伤的恶性循环，从而预防或减缓神经变性疾病的进展，这可能代表了神经变性疾病的一个治疗方向。姜黄素是食用香料姜黄的主要成分，具有抗氧化、抗炎作用。最近的研究亦显示:姜黄素能够通过抗炎作用防护6-羟多巴胺、MPP﹢和MPTP诱导的神经变性;能通过抑制NF-κB和AP-1同DNA的结合来抑制LPS诱导的BV-2细胞 COX-2基因表达［11］;能通过 NF-κB 信号通路抑制促炎症细胞因子的转录而发挥抗炎作用［11］。为此，我们采用姜黄素预处理BV-2细胞的条件培养液来观察鱼藤酮诱导的小胶质细胞的炎症反应对PC12细胞的影响。

我们的研究结果显示，0.5μmol/L～10μmol/L姜黄素条件培养液组与鱼藤酮组比较PC12细胞活力明显增强，1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黄素组的条件培养液对PC12细胞活力影响最显著(P＜0.01)。因为鱼藤酮是细胞线粒体复合物I抑制剂，能够抑制线粒体对氧的利用，从而产生大量ROS。我们推测姜黄素可能通过直接清除BV-2细胞内的ROS保护多巴胺细胞。于是，我们测定BV-2细胞内的ROS结果显示姜黄素明显减少了鱼藤酮诱导的BV-2细胞内的ROS的含量，且以1.0μmol/L和5.0 μmol/L姜黄素作用最强(P ＜0.01)。我们分析:鱼藤酮抑制BV-2细胞线粒体呼吸链对氧的利用，产生大量ROS;而BV-2细胞内ROS的增多又可作为刺激因素促使BV-2细胞释放其它炎症介质［12，13］;BV-2 细胞内 ROS 渗透到细胞外及其产生的炎症介质造成PC12细胞的凋亡［14］。姜黄素通过清除BV-2细胞内 ROS，从而抑制BV-2细胞的激活，减少炎症介质的产生，保护了多巴胺能细胞。

本实验研究证实，姜黄素通过减少小胶质细胞内ROS的生成，或直接清除细胞内ROS，阻断了小胶质细胞激活的恶性循环，从而保护多巴胺能细胞。

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