精原干细胞研究进展

宋瑞高，姚晓磊，石 磊

（山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）

综述与专论

精原干细胞研究进展

宋瑞高，姚晓磊，石 磊

（山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）

精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是各种雄性动物生殖细胞的母细胞，是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，并且在雄性个体中精原干细胞与下一代的遗传背景密切相关。因此，精原干细胞在细胞生物学、医学、转基因等领域的研究有着广阔的应用前景。文章根据国内外相关研究进展，对精原干细胞的生物学特性、分离纯化与培养、移植等作一概述。

精原干细胞；生物学特性；分离纯化；移植

哺乳动物雄性成体中的精子发生系统在雄性配子的产生和进化过程中起着基因传递的作用，这一系统的基础就是精原干细胞（spermatogonial stemcells，SSCs）。精原干细胞位于曲精细管基膜上，其即能自我更新产生新的细胞，也能通过基因或者外来信号的调节进行自我分化，最终产生精细胞，是雄性成体内唯一可复制的二倍体的永生细胞，也是成年哺乳动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞［1］。近几年来精原干细胞移植技术、体外培养技术及冻存技术等新技术的使用，使得精原干细胞的应用成为可能，对于了解精子的发生和调控机制、不孕症的治疗、建立转基因动物模型有重要意义。现对精原干细胞的生物学特性、分离纯化与培养、移植作一简要综述。

1 精原干细胞的生物学特性

精原干细胞是由生殖嵴的原始生殖细胞（primordial germcells，PGCs）分化产生，PGCs先演化为性原细胞，性原细胞再发育为精原干细胞。精原干细胞体积大，外形为圆形或椭圆形，细胞核较大，核仁常位于细胞中央，线粒体和核糖体在胞质中含量较多，细胞中其余细胞器不发达。一般将精原干细胞分为A、B两型。A型细胞核染色质细小，核仁常靠近核膜，而B型细胞的核仁位于中央，核膜内附着有粗大的异染色质［2］。A型精原细胞可以分为单个A型（A-single，As）、成对A型（A-paired，Apr）、链状A型（A-aligned，Aal），该3型细胞统称未分化型精原干细胞。目前认为，仅单个型（A-single）精原细胞具有干细胞性质，因此，精原干细胞又被称为As型精原细胞。As型细胞可以自我更新生成新的干细胞，也可以定向分化形成由两细胞组成的Apr细胞，Apr进一步分裂可形成由4、8、16细胞组成的Aal细胞，再分化形成A1、A2、A3、A4、In和B型细胞。B型细胞可分化为初级精母

细胞，再经减数分裂最终形成精子［3］。As型细胞呈圆形或椭圆形，直径9 μm±1 μm，胞质较少；核大，核呈圆形或椭圆形，有2～3个核仁。Apr型细胞可见通过胞质间桥相连。在电镜下，可以观察到精原细胞镶嵌在支持细胞的侧面，细胞核内常染色质较多，异染色质少，核仁呈网状，有时有空泡［4］。有资料表明［5］，睾丸中精原干细胞仅占其细胞总数的0.02%左右。

2 精原干细胞的分离纯化与培养

2.1 精原干细胞的分离

目前对于精原干细胞的分离主要有3种方法，分别为两步酶消化法、重力沉降法和单酶消化法。其中目前主要采用的为两步酶消化法，不过有人用单酶消化法同样获得了较好的分离效果。

采用两步酶消化法对各种动物的精原干细胞进行分离的结果不同。袁劲涛等［6］分离大鼠精原干细胞获得精原干细胞纯度为85%左右；张秀娟等［7］采用该方法成功分离了小鼠精原干细胞，最终检测得出细胞活率≥90%。其次为重力沉降法，采用单位重力速度沉降法结合差异贴壁法纯化猪的A型精原细胞，获得高达95%～98%的纯化率［8］。武小虎等［9］采用的是单酶消化法探究绵羊精原干细胞的分离，所得的细胞中PGP 9.5阳性细胞达到了76.76%，较前人研究成果有所提高。

2.2 精原干细胞的纯化

目前，精原干细胞的纯化方法主要有Percoll离心、差异贴壁、盘化法、流式细胞分选、免疫磁珠分选、重力沉降法。利用免疫磁珠分离技术可以获得较高浓度的精原干细胞，但用该方法进行纯化时不仅需要选择特异性高的表面抗原，而且还需要专门的设备，另外还需要购买一次性的分离柱和抗体标记的磁珠，成本昂贵。利用流式细胞分选技术分离纯化精原干细胞也可获得大量较纯的精原干细胞，不过需要购买流式细胞仪，使成本增加。因此，目前对于动物的精原干细胞的纯化大都采用Percoll法、差速贴壁法和盘化法，其中以Percoll法和差速贴壁法最为常用。

不同动物采用Percoll法获得的纯化效果不同。薛振华等［10］采用Percoll离心法对分离的达兰猪精原干细胞进行纯化，纯度可以达47.62%；Yu等［11］使用Percoll非连续密度梯度液获得了90.48%的A型大鼠精原干细胞；张学明等［12］用Percoll非连续密度梯度得出小鼠的精原干细胞纯度为68.76%；毕聪明等［13］对5月龄的牛生殖细胞用 Percoll非连续密度梯度法分离，纯化后纯度达69.27%；阿拉达尔［14］采用该方法纯化山羊精原干细胞，最终纯度达84%。其次为差异贴壁法，郑鹏等［15］使用该方法得到了纯度为72%的新生牛精原干细胞。盘化法是利用抗原-抗体或配体-受体间的特异性结合，来进行精原干细胞的分离纯化。陈晓宇等［16］对于湖羊精原干细胞分离后做进一步纯化，得出盘化法处理过的细胞在形态上更为均一，所形成集落的AKP阳性率也显著高于差异贴壁法。

2.3 精原干细胞的培养

目前，能用作精原干细胞体外培养的基础培养基种类较多，并且培养基内的添加成分各异，但一般采用DMEM为基本培养基，也有采用MEM培养基的。Lzadyar等［17］对牛精原干细胞的基本培养条件进行了探索，认为牛精原干细胞的最佳培养基为含2.5%血清的MEM培养基。Kanatsu-Shinohara等［18］使用 StemPro-34 SFM 和StemPro-34 supplement建立起的小鼠精原干细胞体外培养体系，不但能使精原干细胞存活（6个月以上），并且还维持了精原干细胞分化的多能性。Izadyar等［19］用MEM培养小鼠精原干细胞也取得了不错的成果。

精原干细胞体外培养时一般都使用饲养层细胞来抑制精原干细胞分化和保持其增殖能力。常用的饲养层细胞有支持细胞、小鼠成纤维细胞（MEF）、STO饲养细胞和SNL饲养细胞。对于添加剂的使用，一般都要在精原干细胞培养基中添加10%的胎牛血清。但有研究发现，血清可导致精原干细胞分化［20］，因此精原干细胞体外培养基中添加血清的作用还有待进一步研究。培养基中还需添加一些促细胞生长试剂，如丙酮酸钠、非必需氨基酸、谷氨酰胺和β-巯基乙醇等，同时还要添加细胞因子，如白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子 -1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、GDNF（glial cell line-derived neurotrophic factor）、干细胞生长因子（SCF）、颗粒巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。而有研究表明，LIF、bFGF和IGF-1对体外培养精原干细胞的作用不明显甚至有负作用［21］。Shinohara等［22］建立了不使用饲养层细胞及血清的培养体系。这是精原干细胞体外培养的一项巨大进步。

3 精原干细胞的移植

1994 年，Brinster等［23-24］发表了精原干细胞移植的新方法，实现了供体小鼠的精原干细胞在受体中进行精子发生和单倍体的生殖遗传。其后，也有报道将小鼠和仓鼠精原干细胞移入大鼠睾丸后，成功产生了供体精子［25］，但公猪、公牛、大鼠、猴子以及公马的精原干细胞也成功地移植入小鼠睾丸中，却不产生供体精子，这就表明现阶段较大种间跨度的精原干细胞异体移植还不产生精子发生过程。有研究表明，在小鼠［26］、大鼠［27］猪［28］、山羊［29］、狗［30］等物种的同种异体移植均获得了成功。

精原干细胞移植方法主要有3种，最早采用的是曲精细管注射法。Brinster等［23-24］在1994年采用该种方法对小鼠的精原干细胞进行了移植，其主要操作方法是，将供体小鼠的精原干细胞用解剖显微镜注射装置直接注射到受体小鼠的曲精细管中。该研究的成功表明，将供体睾丸中的精原干细胞移植到受体睾丸中，能在受体睾丸中进行正常的精子发生过程，产生的供体精子能够成功使卵子受精产生供体后代。

另两种移植方法为睾丸输出管注射法和睾丸网注射法。输出管注射法操作比较复杂，手术要求较高，不过其比曲精细管注射法快速可靠，适用范围较广。1995年，Jiang等［31］将供体大鼠的雄性生殖细胞采用睾丸网注射法转移到受体睾丸。睾丸网注射法既不需要显微操作仪的帮助，也不需要像输出管注射法那样复杂的解剖，是更加快速方便的方法。对于像牛羊等一些大型动物的轴形睾丸网位于睾丸内部深处，比较难以操作的问题，Schlatt等［32］采用了超声波成像引导注射法，成功地将供体的生殖细胞注入受体睾丸的曲精细管中，曲精细管充满度高达70%。

精原干细胞移植的受体大都为内源性精子发生缺陷的动物，或者用射线照射等人为杀死大部分内源性精原干细胞的动物。但许多其他物种的移植都未进行免疫抑制，也获得了成功［33］，因此对于供体精原干细胞得到免疫豁免机制的原因需进一步探究。

4 精原干细胞研究前景

精原干细胞的研究前景十分广阔，目前对于哺乳类动物精原干细胞的研究较啮齿类动物略微落后，不过它的发展空间更为广阔。通过对精原干细胞的生物学特性的了解，寻找更为合适的分离纯化方法，以及逐步完善精原干细胞体外培养技术，从而建立干细胞系，最终获得临床应用，对濒危动物的保护，不孕症的治疗，干细胞的定向分化与应用都有极其深远的意义，在干细胞生物学、医学、畜牧业等领域具有重要价值。但是将精原干细胞应用于临床尚有伦理、遗传、感染等方面的问题，移植的精原干细胞是否会受体外环境的影响产生基因突变，改变遗传信息，是否会感染未知的病毒等问题都有待于进一步研究。

［1］Schlatt S.Spermatogonial stem cell preservation and transplantation［J］.Mol Cell Endocrine，2002，187：107-111.

［2］杨炜蓉,汪勇，张姣姣.精原干细胞的研究进展［J］.中国畜牧杂志，2013，49（5）：76-80.

［3］Singh S R，Burnicka-turek O，Chauhan C，et al.Spermatogonial stem cells，infertilityand testicular cancer［J］.J Cell Mol Med，2011，15（3）：468-483.

［4］魏彩霞.鸡精原干细胞体外培养及诱导分化的研究［D］.扬州：扬州大学，2007.

［5］王宁，薛京伦.精原干细胞技术的研究进展［J］.国外医学遗传学分册，2003，26（1）：5-7.

［6］袁劲涛，周源，韩晓冬.大鼠精原细胞的分离纯化及鉴定［J］.医学研究生学报，2010，23（6）：565-568.

［7］张秀娟，李莉，张守全，等.小鼠精原干细胞分离培养条件的优化［J］.华南农业大学学报，2012，33（1）：87-91.

［8］Dirami G，Ravindranath N，Pursel V，et a1.Effects of stem cell factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor on survival of porcine type a spermatogonia cultured in KSOM［J］.Biol Reprod，1999，61（1）：225-230.

［9］武小虎.Percoll非连续梯度法分离未成年绵羊精原细胞的研究［D］.兰州：甘肃农业大学，2012.

［10］薛振华，刘国世，史建民，等.达兰猪精原干细胞的分离纯化和初步鉴定［J］.中国农业大学学报，2008，13（2）：1-6.

［11］Yu R J，Xu S F.Isolation and purification of rat A spermatogonia stem cells［J］.Anhui Journal of Preventive Medicine，2007，28（3）：169-172.

［12］张学明，赖良学，李德雪，等.小鼠精原细胞的分离和纯化［J］.解剖学报，2000，31（3）：235-238.

［13］毕聪明，张仕强.牛精原干细胞的分离和纯化及体外培养的一般特性［J］.畜牧兽医学报，2006，37（10）：977-981.

［14］阿拉达尔.山羊精原干细胞体外培养体系的建立及移植研究［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2007.

［15］郑鹏，李冬旭，田亚光，等.新生牛睾丸细胞的分离纯化与冷冻保存［J］.东北农业大学学报，2010，41（2）：96-100.

［16］陈晓宇，朱志伟，潘建治.湖羊精原干细胞体外培养［J］.浙江农业学报，2010，22（5）：580-584.

［17］Izadyar F，Den Ouden K，Creemers L B，et al.Proliferation and differentiation of bovine type A spermatogonia during long-term culture［J］. Biol Reprod，2003，68：272-281.

［18］Kanatsu-shinohara M，Ogonuki N，Inoue K，et al.Long-term prolif--eration in culture and germline transmission of mouse male germline stemcells［J］.Biol Reprod，2003，69（2）：612-616.

［19］Izadyar F，SpierenbergGT，Creemers LB，et al.Isolation and purification of type a spermatogonia from the bovine testis［J］.Reproduction，2002，124（1）：85-94.

［20］Hamra F K，Chapman K M，Nguyen D M，et al.Self renewal，expansion，and transfection of rat spermatogonial stem cells in culture［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（48）：17430-17435.

［21］王璞，陈建泉，成国祥.精原干细胞途径制作转基因动物［J］.细胞生物学杂志，2008，30：475-478.

［22］Shinohara T，Avarbock MR，Brinster R L.Beta1-and alpha 6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（10）：5504-5509.

［23］Brinster R L，Zimmermann J W.Spermatogenesis following male germ cell transplantation［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1994，91：11298-11302.

［24］Brinster R L，Avarbock MR.Germline transmission of donor haplotype

following spermatogonial transplantation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：11303-11307.

［25］Ogawa T，Dobrinski I，Avarbock MR，et al.Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster germ cells to mouse testes［J］. Biol Reprod，1999，60（2）：515-521.

［26］Shinohara M K，Ogonuki N，Inoue K，et al.Allogeneic offspring produced by male germline stem cell transplantation into infertile mouse testis［J］.Biol Reprod，2003，68：167-173.

［27］Ogawa T，Dobrinski I，Brinster R L.Recipient preparation is critical for spermatogonial transplantation in the rat［J］.Tissue Cell，1999，31（5）：461-472.

［28］Honaramooz A，Megee S O，Dobrinski I.Germ cell transplantation in pigs［J］.Biol Reprod，2002，66（1）：21-28.

［29］HonaramoozA，Behboodi E，Blash S，et al.Germcell transplantation in goats［J］.Mol Reprod Dev，2003，64（4）：422-428.

［30］Kim Y，Turner D，Nelson J，et al.Production of donor-derived sperm after spermatogonial stemcell transplantation in the dog［J］.Reproduction，2008，136（6）：823-831.

［31］Jiang F X，Short R V.Male germ cell transplantation in rats：apparent synchronization of spermatogenesis between host and donor seminiferous epithelia［J］.Int J Androl，1995，18：326-330.

［32］Schlatt G，Rosiepen S，Weinbauer G F，et al.Germ cell transfer into rat，bovine，monkeyandhumantestes［J］.HumanReprod，1999，14：144-150.

［33］Herrid M，Vignarajan S，Davey R，et al.Successful transplantation of bovine testicular cells to heterologous recipients［J］.Reproduction，2006，132（4）：617-624.

Advance in Spermatogonial Stem Cells

SongRui-gao，YaoXiao-lei，Shi Lei
（College ofAnimal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Spermatogonial stemcells are oocytes ofmale mamals germcells which not onlycan maintain the number ofthemselves but also can differentiate to spermatocyte.Spermatogonial stem cells are also closely related to the genetic background of the next male generation individuals.Therefore，the study of spermatogonial stem cells in the field of cell biology，medicine and transgene has broad application prospects.In this review，biological characteristics，isolation，purification，cultivation and transplantation of spermatogonial stemcells were discussed.

spermatogonial stemcells；biological characteristics；isolation；purification；cultivation；transplantation

Q2

A

2095-3887（2014）05-0054-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.017

2014-06-09

山西省青年基金项目（2012021027-6）；山西农业大学科技创新基金（201201）

宋瑞高（1990-)，男，硕士研究生。

石磊（1980-），男，副教授，博士。主要从事动物生殖生理和繁殖营养调控等方面的研究。