高效液相色谱法（HPLC）测定饲料中AC4的含量

2014-01-22肖文龙张可煜王昊欣薛飞群张丽芳

饲料工业 2014年3期

■肖文龙张可煜吴昊王昊欣薛飞群张丽芳

（中国农业科学院上海兽医研究所中国农业科学院兽药安全评价与残留研究重点开放实验室/动物药学研究室，上海 200241）

球虫病是危害养禽业的重大原虫病，多年来药物是球虫的防治主要依赖于三嗪类、磺胺类等抗球虫药物。然而，当前临床上球虫耐药性普遍，防治效果越来越低下，亟需安全、高效、无交叉耐药的新型抗球虫药物以应对这一局面。AC4是中国农业科学院上海兽医研究所设计合成的新型结构三嗪类化合物。已有的研究结果显示，该药不仅具有良好的抗球虫效果，抗球虫指数（ACI）达185～200，与地克珠利、妥曲珠利等其它三嗪类化合物无交叉耐药性，而且无致畸、致癌、致突变作用，有望成为新型的抗球虫药物。

饲料添加是抗球虫药物普遍使用的一种给药方式，同时在30、90 d喂养试验等一般毒理学研究也常采用混饲的给药方法。然而，目前饲料中AC4的检测方法仍未建立，这使得AC4饲料预混剂的质量标准研究以及如何确保毒理学研究中饲料添加AC4的含量稳定，质量可靠受到挑战。因此，本研究采用高效液相色谱方法建立起AC4在饲料中的含量检测，以为饲料样品中AC4质量的控制提供方法。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Waters 2690高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2487检测器（美国Waters公司）；氮吹仪(美国organomation Associates公司)；离心机(AnkeLXJ-ⅡB，上海安亭科学仪器厂)；涡旋混合器（XW-OA，上海医科大学仪器厂）；AE240双量程分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；超纯水系统（上海瑞枫生物科技有限公司）；

1.2 药品和试剂

AC4对照品（含量≥99.8%，由上海兽医研究所动物药学研究室制备）；乙酸乙酯，石油醚，正己烷，N，N-二甲基亚砜，磷酸，甲醇等试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。所用水均为超纯水。

1.3 溶液的配制

称取0.500 g AC4标准品置于25 ml容量瓶中，用N，N-二甲基亚砜溶解配成20 mg/ml的标准储备液，然后取适量用N，N-二甲基亚砜分别稀释成15 mg/ml、5 mg/ml、1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml系列浓度溶液，于常温保存。

1.4 样品的前处理

1.4.1 样品的提取

称取2.00 g饲料于50 ml具塞离心管中，加入20 ml乙酸乙酯，涡动1 min，300 r/min振荡30 min，超声15 min，4 000 r/min离心10 min，取10 ml上清置于另一离心管中，加入10 ml石油醚涡动混匀，4 000 r/min离心10 min。取混合液10 ml，于40℃水浴下氮气吹干。

1.4.2 样品的净化

向吹干的残渣中加入6 ml甲醇涡动1 min，超声10 min，然后依次加入4 ml超纯水，10 ml正己烷，4 000 r/min离心10 min，弃掉上层正己烷层及中层油脂层，下层留2 ml左右液体过0.22 μm微孔滤膜上HPLC测定。

1.5 色谱条件的确定及方法学验证

1.5.1 色谱条件的确定

以甲醇和0.2%磷酸水溶液为流动相，通过高效液相色谱仪进行样品的分离，通过改变流动相的比例达到分离各峰的目的。

1.5.2 方法特异性

取AC4标准品溶液，空白饲料，空白饲料加标样品分别按1.4节处理，在上述HPLC条件下进行测定，记录色谱图。

1.5.3 定量限和检测限的确定

取 100 μg/ml标准储备液，分别稀释成 10、7.5、2.5、2 μg/ml系列浓度溶液，分别取400 μl加到空白饲料中，按照1.4节样品提取和纯化方法进行前处理，并在已经确定的HPLC条件下进行测定，记录色谱图。以检出的目标峰峰高为10倍基线噪音值时所对应的溶液浓度为该方法的定量限浓度，以检出的目标峰峰高为3倍基线噪音值时所对应的溶液浓度为该方法的检测限浓度。

1.5.4 线性关系

分别取 15 mg/ml、5 mg/ml、1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml AC4系列浓度溶液400 μl分别加于2.00 g空白饲料中，按照1.4节样品提取和纯化方法进行前处理，在已确定的色谱条件下进样并进行HPLC分析，每个浓度点做5个平行，根据色谱峰面积和标准溶液浓度进行线性回归，确定回归方程、相关系数和线性范围。

1.5.5 精密度测定

向2.00 g空白饲料中分别添加100 μg/ml、5 mg/ml和20 mg/ml AC4标准溶液各400 μl，使AC4在饲料中的浓度分别为低、中、高3个添加浓度，即20 mg/kg、1 000 mg/kg和4 000 mg/kg，按照1.4节样品提取和纯化方法进行前处理，并在已经确定的HPLC条件下进行测定，每个浓度做5个平行，计算AC4的日内变异系数。此外，采用相同的方法连续3日每日重复1次，共3次，计算AC4的日间变异系数。

1.5.6 回收率

向2.00 g空白饲料中分别添加100 μg/ml、5 mg/ml和20 mg/ml AC4标准溶液各400 μl使AC4在饲料中的浓度分别为低、中和高3个添加浓度，即20 mg/kg、1 000 mg/kg和4 000 mg/kg，按照1.4节样品提取和纯化方法进行前处理，并在已经确定的HPLC条件下进行测定，每个浓度做5个平行，计算AC4在饲料中的回收率。

2 结果与分析

2.1 饲料中AC4含量的HPLC检测条件（见图1）

图1 饲料中AC4含量检测的HPLC色谱

由图1可知：分析柱为C18，粒径5 μm,流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液（体积比为65∶35），流速1.0 ml/min，检测波长为251 nm，进样量为10 μl，柱温为30℃的条件下，可以实现饲料中AC4的良好分离。

2.2 饲料中AC4含量HPLC检测方法的验证

灵敏度：由试验结果可知，AC4在饲料中的定量限为1.5 mg/kg，检测限为0.02 μg/ml。

线性关系：以AC4标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。结果显示，AC4在20～4 000 mg/kg的添加浓度范围内，具有较好的线性关系（R2＞0.999），回归曲线和方程见图2。

添加回收率及精密度（见表1）：从各添加浓度范围内的回收率结果可以看出，AC4的平均加标回收率为98.4%～106.4%，日内变异系数为0.7%～4.6%，日间变异系数为3.6%～4.3%。证明本实验建立的方法具有较高的准确度及精密度，符合测定要求。

图2 AC4在饲料中的标准曲线

表1 饲料中AC4的回收率和精密度的检测结果(n=5)

2.3 实际样品测定

按上述方法测定含待测药物AC4 100 mg/kg和2 500 mg/kg的高压鼠料各3份。检测结果表明，含量100 mg/kg药物的饲料中AC4回收率分别为78.9%，76.3%和84.7%，平均回收率为80.0%，相对标准偏差为5.4%；含量2 500 mg/kg药物的饲料中AC4的回收率分别为83.4%，83.3%和84.6%，平均回收率为83.8%，相对标准偏差为0.8%。

3 讨论

3.1 仪器条件的选择

本研究根据AC4的结构特点，采用C18反相色谱柱，紫外检测波长251 nm，用甲醇、已腈、水、缓冲盐等采用不同比例作流动相考察AC4与饲料中其他组分的分离效果。实验结果表明采用乙腈-水系统AC4出峰时间较晚，甲醇-水系统出现主峰拖尾及出峰较晚的现象，采用甲醇-水-磷酸体系能实现主成分和各杂质的良好分离。然后根据不同比例流动相的比较、优化确定流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液（65/35）。该流动相条件下峰形对称，分离效果好，可用于饲料中AC4的含量测定。

3.2 样品的提取

AC4在水中几乎不溶解，在乙腈、氯仿、乙酸乙酯中微溶，在甲醇中略溶。由于氯仿是低毒物质，且密度大，离心位于离心管下部，影响操作的准确性。故本实验考察了乙腈、乙酸乙酯和甲醇的提取效果。实验结果表明，乙腈提取的物质杂质最少，但回收率较低；甲醇的回收率最高，但是甲醇提取的杂质也较多；所以提取溶液选择了乙酸乙酯，乙酸乙酯的提取回收率可以达到检测要求的同时提取的杂质峰的干扰较甲醇的少。有研究表明[4]，在提取过程中加入PBS缓冲液对饲料进行润湿可以提高药物回收率，本试验在前处理方法摸索时对此进行了考查，结果表明在主成分AC4回收率提高的同时，杂质的回收率也同样提高，而且杂质的提高幅度大于主成分，考虑到不加PBS也能达到检测的要求，遂放弃加入PBS缓冲液。

3.3 样品的净化

本研究采用液液萃取的方法，用正己烷和石油醚萃取油脂净化。本研究先采用石油醚进行萃取净化，然后把溶液氮吹吹干，加入流动相比例溶液复溶，再在复溶的溶液中加入正己烷进一步的萃取净化，由于正己烷位于上层，中间为油脂层，故弃掉正己烷层及油脂层很容易操作，因为加入10 ml流动相复溶，只要留下2 ml左右溶液过滤进样，这样就不会出现抽取样品不全导致的误差，而且整个步骤简单易行。