几种氨基酸及其衍生物对猪肠上皮细胞IPEC-1细胞活力与生长的影响

2014-01-22欧阳万金龙民慧侯永清丁斌鹰

饲料工业 2014年3期

■欧阳万金龙民慧侯永清肖航丁斌鹰易丹王蕾

（动物营养与饲料科学湖北省重点实验室武汉轻工大学，湖北武汉 430023）

L-谷氨酰胺（L-glutamine，GLN）是母体乳汁中一种含量非常丰富的游离氨基酸，也是条件性必需氨基酸。GLN不仅作为肠上皮细胞的主要能量物质，为小肠上皮细胞的分化和增殖提供能量，而且还可通过调节谷氨酰胺酶活性、相关细胞信号通路和蛋白合成等促进肠上皮细胞的增殖。研究表明，GLN可促进细胞增殖和肠道发育，缓解各种因素导致的细胞凋亡。

Nα-乙酰-L-谷氨酰胺（Nα-acetyl-L-glutamine，NAG）是GLN乙酰基化的衍生物，其生理功能与谷氨酰胺相似，但在水溶液中比谷氨酰胺稳定。NAG可治疗胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病，在治疗脑功能障碍和神经系统疾患方面都有很好效果。近年研究发现，NAG能促进氨基酸转运，加强细胞谷胱甘肽和DNA合成，促进细胞分裂增殖，可作为高强度训练恢复过程中的营养支持物。

L-精氨酸（L-arginine，ARG）是胎儿和新生儿的必需氨基酸，成年动物的条件性必需氨基酸，也是组织蛋白最丰富的氮源及细胞合成肌酸、脯氨酸、谷氨酸、多胺和一氧化氮等的前体。有研究发现，ARG可改善动物繁殖性能、心血管功能、神经系统和胃肠道发育，调控免疫能力；体外研究发现，ARG还可促进哺乳动物细胞增殖和癌细胞凋亡，这为ARG的以上功能提供了理论依据。

L-瓜氨酸（L-citrulline，CIT）是一种非蛋白质α-氨基酸，具有肽键形成能力，但不参与蛋白质的合成。它是人体尿素循环中间产物，与人体氨氮排泄有非常重要关系。有研究表明，CIT具有提高机体免疫力，促进血液循环，诊断类风湿关节炎，作为异体排斥效应的指示剂、反映肠道衰竭程度，增强男性和雄性动物性功能，抗氧化，维持肌肉功能等生理功能。

α-酮戊二酸（Alpha-ketoglutaric acid，AKG）是三羧酸循环重要中间产物，也是动物机体谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等的合成前体物。研究表明，AKG可改善能量状态、增强肠道功能，缓解急性肺损伤，维持氧化还原平衡和提高动脉弹性；AKG在体外可促进细胞内蛋白合成，抑制癌细胞凋亡。

L-脯氨酸（L-Proline，PRO）是明胶、麸蛋白、玉米醇溶蛋白、鲱精蛋白、酪蛋白等多种蛋白的组成成分，特别是明胶中最多（约占20%）。PRO是合成人体蛋白质重要氨基酸之一，是氨基酸输液的重要原料，也是合成卡托普利、依那普利等一线降压药物的主要中间体，已被广泛应用于食品和医药工业。在食品上的用途，PRO主要做营养增补剂和风味剂，与糖共热发生氨基酸-羰基反应生成特殊的香味物质。PRO是胶原蛋白的重要组成部分，对胶原合成、细胞外基质产生及免疫细胞调节的伤口愈合和恢复至关重要。PRO在孕体代谢、生长和发育中有重要作用，对治疗子宫生长受限有潜在价值。葛奎等发现，PRO等活性分子在创面愈合过程中发挥重要调节作用。

ARG、NAA、CIT、PRO、AKG、GLN和NAG都是具有重要生理功能的物质，相互之间也存在密切关系。NAA可以在体内通过脱乙酰基作用生成ARG，发挥ARG的的功能；CIT在肾脏中可以合成ARG，而在小肠中ARG在鸟氨酸氨甲酰基转移酶的作用下可以生成CIT；猪小肠能吸收GLN并释放CIT和ARG，泌乳母猪吸收大量的ARG和支链氨基酸，代谢形成脯氨酸和GLN；NAG通过脱乙酰基作用生成GLN；PRO是合成鸟氨酸的原料，通过脯氨酸氧化酶作用生成吡咯啉-5-羧酸，并进一步通过鸟氨酸转氨酶形成CIT；AKG具有谷氨酰胺碳架，通过谷氨酰胺脱氢酶或转氨酶作用生成谷氨酸，并进一步通过谷氨酰胺合成酶形成GLN。

本试验通过研究GLN、NAG、PRO、ARG、NAA、CIT和AKG对猪小肠上皮细胞活力与生长的影响，探明这几种氨基酸及其衍生物对肠道细胞生长的作用效果，筛选出可有效促进猪肠上皮细胞生长的氨基酸或其衍生物，为进一步研究这几种功能性氨基酸对肠道功能的影响提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

猪小肠上皮细胞-1（IPEC-1,Texas A&M University），L-谷氨酰胺（Amresco公司），Nα-乙酰-L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、N-α-乙酰-L-精氨酸、L-瓜氨酸、α-酮戊二酸均为Sigma公司试剂，胎牛血清（FBS）和双抗（PSF）为Gibco公司试剂，DMEM-F12（Hyclone公司）、定制DMEM培养基为市售产品。

1.2 方法

1.2.1 试验分组

试验分两次进行，试验处理及分组情况见表1～表3。

表1 试验一处理与分组

表2 试验二处理与分组

表3 试验三分组

1.2.2 细胞培养

IPEC-1用含5%FBS和1%PSF的DMEM-F12培养基（包含17.5 mM D-葡萄糖，2.5 mM L-谷氨酰胺，0.7 mM L-精氨酸，15 mM HEPES（pH=7.4），5 μg/ml胰岛素，5 μg/ml转铁蛋白，5 ng/ml硒，5 μg/l EGF），于37℃、5%CO2条件下培养，隔天换液，实验时选用对数生长期的细胞经消化制成细胞悬液，计数调整浓度。

1.2.3 CCK8法测定不同氨基酸及其衍生物对细胞活力的影响

细胞以约5×104个/ml接种于96孔板（Corning公司，USA）中，每孔接种0.1 ml。置于37 ℃，5%CO2的孵箱培养过夜，细胞贴壁后，弃去孔中培养液，加入0.1 ml相应的特制DMEM培养基，以测定氨基酸及其衍生物对IPEC-1细胞活力的影响。细胞每天换液，分别在试验的第1、2、3、4 d测定OD值。测定方法：仔细吸出孔中原有培养液，每孔加入110 μl混合液（10 μl CCK8 试剂与 100 μl各组相应的特制培养基），继续在孵箱中孵育一定时间，用酶标仪（Bio-Rad公司）在450 nm波长（参考波长为650 nm）下测定其吸光度（optical density，OD）。

1.2.4 不同氨基酸及其衍生物对细胞生长的影响

细胞以约4×104个/ml接种在24孔板（Corning公司，USA）中，每孔接种2 ml。置于37 ℃，5%CO2的孵箱培养过夜，细胞贴壁后，仔细弃去孔中培养液，加入2 ml相应的定制DMEM培养基，以测定不同氨基酸及其衍生物对IPEC-1细胞生长的影响。细胞每天换液，分别在试验的第1、2、3、4 d用自动细胞计数仪计数（Bio-Rad公司，Singapore）并计算各孔细胞数量。

1.3 数据处理

全部数据用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan氏多重比较，所得数据采用平均值±标准差表示。P＜0.05为差异显著性。

2 结果与分析

2.1 NAG和GLN对IPEC-1细胞生长的影响(见表5)

由表5可知，在试验的1至4 d，GLN组细胞数量均显著多于对照组（P＜0.05）；在前3 d，NAG组细胞数量与对照组比差异不显著（P＞0.05），但显著低于GLN组（P＜0.05）。第4 d，NAG组细胞数量显著高于对照组（P＜0.05），但与GLN组差异不显著（P＞0.05）。

表4 定制DMEM培养基组分

表5 NAG和GLN对IPEC-1细胞生长的影响

2.2 ARG、NAA、CIT和AKG对IPEC-1细胞生长的影响

2.2.1 对IPEC-1细胞OD值的影响(见表6)

由表6可知，在试验的第1～4 d，GLN组细胞OD值显著高于对照组和其它试验组（P＜0.05）；NAA组细胞OD值显著低于对照组（P＜0.05）。前2 d，ARG组、CIT组和AKG组细胞OD值均显著低于对照组（P＜0.05）。

表6 ARG等对IPEC-1细胞OD值的影响

2.2.2 对IPEC-1细胞数量的影响(见表7)

表7 ARG等对IPEC-1细胞数量的影响

由表7可知，在试验的第1～4 d，GLN组细胞数量显著高于对照组和各处理组（P＜0.05）；在第2 d，AKG组细胞数量显著高于对照组、CIT组和NAA组（P＜0.05）。在第4 d，AKG组细胞数量显著高于对照组（P＜0.05）；CIT组极显著高于对照组（P＜0.01）；ARG组和NAA组显著高于对照组（P＜0.05）。

2.3 PRO对IPEC-1细胞生长的影响(见表8)

由表8可知，在试验第1～4 d，两个试验组细胞数量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），两试验组之间差异也不显著（P＞0.05）。

表8 PRO对IPEC-1细胞生长的影响

3 讨论

肠道是营养物质代谢、消化和吸收的主要器官。肠道也是机体与外界环境接触表面积最大的器官，也是体内最大的免疫器官。促进仔猪小肠上皮细胞增殖，对促进仔猪肠道发育、对维持仔猪健康、促进仔猪生长具有重要意义。

3.1 GLN和NAG对IPEC-1细胞活力与生长的影响

GLN是快速生长和分化细胞如淋巴细胞、肠上皮细胞等的重要能量底物，也是蛋白质代谢的重要调节因子。GLN是肠上皮细胞增殖必需的氨基酸，其缺乏会诱导上皮细胞凋亡。

GLN能促进人结肠癌细胞Caco-2和HT-29、鼠空肠上皮细胞（IEC-6）以及鲤鱼IEC的增殖。本试验一和试验二结果显示，GLN组细胞数量和OD值显著高于对照组，说明0.5 mM GLN能提高IPEC-1的细胞活性，促进其生长，这与聂新志等人的研究结果一致。同时，本试验一结果又显示，第4 d NAG组细胞数量显著高于对照组，可知NAG可促进第4 d IPEC-1细胞的生长。

3.2 AKG对IPEC-1细胞活力与生长的影响

动物在生命活动中，必须从外界环境摄取营养物质，作为机体活动和组织生长的物质和能量来源。氨基酸是小肠的主要能源物质，小肠黏膜上皮细胞的自我更新、高度有序结构的维持和各种生理功能的进行都需要能量，GLN和谷氨酸可作为小肠的主要能量物质，为诸如营养物质转移和高效率的细胞内蛋白质周转等肠道ATP依赖性的代谢过程提供能量。AKG是小肠肠道重要代谢燃料之一，可以节省谷氨酸和GLN的消耗，约80%AKG的氧化是在肠道中完成。

本实验室的前期结果表明，AKG可在一定程度上提高断奶仔猪的生长性能，改善小肠组织学形态和吸收功能，提高抗氧化能力；日粮添加1%AKG可有效缓解LPS慢性应激导致的仔猪小肠黏膜损伤。

研究表明，AKG为GLN的最佳替代物。本试验结果表明，AKG组细胞数量和OD值均显著低于GLN组，表明体外条件下AKG不能完全替代GLN。这与动物试验的结果并不一致，可能是体外条件下肠上皮细胞对AKG的吸收利用率有关。

3.3 ARG和NAA对IPEC-1细胞活力与生长的影响

动物机体中几乎所有组织均利用ARG合成胞浆蛋白和核蛋白，ARG在促进肌肉内蛋白质合成、增加机体氮储留、增强机体的免疫力、细胞分裂、伤口复原和激素分泌等各种生理过程中，都有着重要的作用。ARG是内生性一氧化氮(NO)的唯一前体。ARG是动物体蛋白质合成所必需的氨基酸，在应激状态下和特殊生长阶段，ARG为必需氨基酸，体内合成的ARG不能满足动物生理代谢需要。研究表明，ARG的不足是断奶仔猪无法达到最大生长速度的重要因素。

Tan等研究结果表明，上皮细胞培养液中较适宜上皮细胞的增殖及蛋白质转化的精氨酸浓度为0.3 mM，低于0.15 mM时对细胞增殖无影响。本试验二结果显示，添加0.25 mM ARG组细胞数量与对照组差异不显著，提示在非应激状态下，0.1 mM ARG可能已满足IPEC-1细胞生长的需要；ARG组和NAA组细胞数量和OD值显著或极显著低于GLN组，说明在无GLN的条件下，ARG和NAA并不能促进IPEC-1细胞的生长；第4 d NAA组细胞数量高于对照组，提示NAA可促进第4 d IPEC-1细胞的生长。

3.4 CIT对IPEC-1细胞活力与生长的影响

CIT是一种非必需氨基酸，它是在动物体内鸟氨酸循环中产生的，不是体内任何重要蛋白质和酶的组成，一般只产生在鸟氨酸转化为尿素的循环过程中，但CIT对体内氮的平衡和新陈代谢方面起着很重要的作用。CIT被吸收后在肾脏、大脑、肌肉和一些其他组织中转化为ARG和NO。ARG及NO均可促进仔猪的生长发育。研究发现，CIT可提高仔猪生长性能，促进动物生长。本试验二结果显示，第4 d，CIT组细胞数量显著高于对照组，说明CIT可促进第4 d IPEC细胞的生长。

3.5 PRO对IPEC-1细胞生长的影响

PRO是新生仔猪肠细胞生成CIT和ARG的主要前体物，具有防止淋巴细胞凋亡、刺激细胞生长、促进抗体产生等作用。研究表明，在仔猪早期快速生长时期，PRO可能是必需氨基酸，内源合成的PRO在为新生仔猪和断奶仔猪提供精氨酸方面起到重要作用。Brunton等发现，ARG和PRO是小猪肠道不可缺少的氨基酸。本实验室前期动物试验表明，日粮添加PRO可在一定程度缓解LPS多次刺激导致的仔猪生长抑制和肠道损伤，可能是通过细胞因子以及抗氧化能力的提高缓解LPS刺激对仔猪造成的应激。本次试验结果显示，0.2 mM PRO组和0.4 mM PRO组细胞数量与对照组相比无明显差异，这可能说明在正常生理状态下，PRO对肠道功能无影响，而在应激条件下，脯氨酸对肠道功能有保护作用。