清胰颗粒减轻急性出血坏死性胰腺炎大鼠早期肺损伤

张淑坤，崔乃强，张艳敏，卓玉珍

天津市中西医结合急腹症研究所（天津300100）

急性出血坏死性胰腺炎（acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis，AHNP）是以胰腺坏死为特征的全身炎性疾病，早期即可并发肺损伤[1]。Toll样受体4（Toll-like receptor-4，TRL-4）介 导 的p38MAPK（p38 mitogen-activated protein kinase）信号通路的活化是调控炎症反应的中心环节，在胰腺炎导致肺损伤中起放大炎症作用[2-3]。本实验观察了复方中药提取物清胰颗粒对AHNP大鼠早期肺损伤和p38MAPK信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠72只，体质量（280±20）g，购于中国医学科学院实验动物研究所。

1.1.2 实验药物及主要试剂 清胰颗粒由本研究所药物研究室提供[4]。牛磺胆酸钠购自美国Sigma Al-drich贸易有限公司。MPO测定试剂盒为南京建成生物公司产品。总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自美国Promege公司。实时荧光定量PCR反应混合液购自北京Tiangen公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模型制备和处理 72只Wistar大鼠随机分为假手术组、AHNP组、清胰颗粒组。每组再分为制模后6 h、12 h和24 h 3个时点亚组。采用胆胰管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠制备AHNP动物模型[5]，假手术组仅胆胰管逆行注射生理盐水。清胰颗粒组于制模前2 h给予清胰颗粒水溶液灌胃，以后每12 h灌胃1次，剂量按60 kg成人每公斤体重的15倍换算。各组大鼠分别于制模后6 h、12 h和24 h取左肺分别行苏木精-伊红(HE)染色观察病理改变并评分，检测MPO活性；取右肺100 mg置入RNA溶解缓冲液，匀浆后-80℃保存。

1.2.1 HE染色和病理学评分 左肺下叶用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，5μm厚度连续切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察肺组织病理改变，参照以下标准进行评分[6]：0分：无肺泡壁水肿，间质无炎细胞浸润，间质及肺泡腔无出血。1分：轻度肺泡壁水肿，间质少量炎细胞浸润，间质及肺泡腔少量出血，范围<25%。2分：中度肺泡壁水肿，间质及部分肺泡腔内有较多的炎细胞浸润、毛细血管淤血，出血范围25%～50%。3分：肺泡及间质广泛水肿，大部分肺泡和间质有明显炎细胞浸润，肺泡腔出血范围50%～70%。

1.2.2 MPO活性 称取左肺组织2 g，匀浆，按试剂盒说明用酶化学法检测MPO活性。

1.2.3 实时荧光定量PCR 取150μL肺组织匀浆液按试剂盒说明提取总RNA。经纯度鉴定和浓度测定后，取1.0μg总RNA行逆转录。2.0μL的cDNA行实时荧光定量PCR。TRL-4上游引物:5'-CTGGGTTTCTGCTGTGGACA-3'，下游引物:5'-AGGTTAGAAGCCTCGTGCTCC-3'，扩增片段长度为181 bp；p38MAPK上游引物:5'-GCACACTGATGACGAAATGACC-3'，下游引物：5'-CCCACGGACCAAATATCCACT-3'，扩增片段长度为111 bp；HPRT上游引物:5'-CATGTTTGTGTCATCAGCG-3'，下游引物：5'-ACTAAGTAGATGGCCACAG-3'，扩增片段长度为139 bp。25μL反应体系，反应参数:95℃变性3 min，之后95℃变性20 s，57℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40个循环。目的基因的相对表达量=2-[Ct(目的)－Ct(内参)]。

1.3 统计学方法 计量数据以均数±标准差(x±s)表示。应用SPSS 13.5统计软件单因素方差分析（one-way ANVOVA）检验各组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变和评分 假手术组大鼠肺组织病理无明显改变，AHNP组6 h即可见肺泡及间质广泛水肿、炎细胞浸润，大部分间质和肺泡腔出血，12 h、24 h病变仍持续存在；清胰颗粒组各时点水肿、炎细胞浸润和出血均较模型组减轻（图1）。各时点AHNP组病理评分均较假手术组升高有显著性；与相应时点AHNP组比较，清胰颗粒组肺组织病理评分降低有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 各组大鼠不同时点肺组织病理学评分(±s)

表1 各组大鼠不同时点肺组织病理学评分(±s)

注：与同时点假手术组比较，a P＜0.05；与同时点AHNP组比较，b P＜0.05

分组假手术组AHNP组清胰颗粒组n8 8 8 6 h 1.17±0.41 2.23±0.71a 2.14±0.69a 12 h 1.16±0.75 2.43±0.53a 1.94±0.30a、b 24 h 1.08±0.78 2.38±0.64a 1.76±0.58a、b

2.2 肺组织MPO活性 AHNP组大鼠肺组织MPO活性较假手术组升高（P＜0.05）；与相应时点AHNP组比较，清胰颗粒组肺组织MPO活性降低有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 各组大鼠不同时点肺组织MPO活性（±s,U/g）

表2 各组大鼠不同时点肺组织MPO活性（±s,U/g）

注：与同时点假手术组比较，a P＜0.05；与同时点AHNP组比较，b P＜0.05

分组假手术组AHNP组清胰颗粒组n 8 8 8 6 h 0.65±0.18 1.84±0.52a 1.08±0.38a、b 12 h 0.77±0.23 2.02±0.64a 1.06±0.27b 24 h 0.73±0.15 2.34±0.53a 0.97±0.30b

2.3 TRL-4和p38MAPK mRNA表达 AHNP组大鼠肺组织TRL-4和p38MAPK mRNA表达水平较假手术组升高（P＜0.05）；与同时点AHNP组比较，清胰颗粒组于造模后6 h、12 h和24 h TRL-4和p38MAPK mRNA表达均降低有显著性差异（P＜0.05，见表3）。

3 讨论

在AHNP发生早期，即有中性粒细胞聚集黏附于肺微血管内皮细胞，释放大量细胞因子和炎症介质，是导致急性肺损伤和其他重要器官损伤发生的主要机制之一。MPO为中性粒细胞所特有酶，而且每个细胞所含的酶的量是一定的，约占细胞干重的5%，所以测定MPO活性是能很好的反应中性粒细胞数目和浸润程度。我们的实验结果表明，清胰颗粒能降低AHNP大鼠肺组织病理评分和MPO活性，提示清胰颗粒有减轻AHNP早期肺组织病理损伤和中性粒细胞浸润作用。

图1 各组大鼠不同时点肺组织病理学变化

表3 各组大鼠不同时点肺组织TRL-4和p38MAPK mRNA表达

肺血管内皮细胞存在多种Toll样受体亚型，其中TRL-4可介导细胞对LPS的识别，激活p38MAPK信号通路。p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员之一，静息状态下主要分布于细胞浆，激活后转移至细胞核内，通过磷酸化转录因子来调节TNF－α、IL－6等促炎因子的表达和释放[7]。所以p38 MAPK信号通路被认为是调控炎症反应的中心环节，处于活化状态的p38 MAPK信号通路促进合成和分泌大量的早期促炎介质，在引发炎症级联反应中起重要作用[8-9]。在大鼠出血性休克导致肺损伤的研究中，检测到了p38MAPK被激活，而p38MAPK抑制剂FR167653能减轻肺损伤[10]；在TRL-4基因突变小鼠的肠缺血再灌注导致肺损伤模型，肺组织p38MAPK活化明显被抑制[9]；我们在大鼠AHNP导致肺损伤，检测到肺组织TRL-4和p38MAPK mRNA表达水平升高，这些研究结果提示TRL-4介导p38 MAPK信号通路的激活极有可能参与了各种因素导致肺损伤的发生。

我们的研究还发现，给予AHNP大鼠清胰颗粒在减轻肺损伤同时能降低肺组织TRL-4和p38MAPK mRNA表达水平，提示清胰颗粒保护AHNP大鼠肺组织的作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路，减少炎症因子释放有关有关。

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