中低位直肠癌区域淋巴结微转移

周 宏，夏建福，殷 禹，李日增，杨大庆

浙江省温州市中心医院1.肛肠外科；2.病理科（温州325000）

直肠癌的淋巴结检出率低于直肠癌本身的检出，使得检出阳性淋巴结几率减少，直肠癌总体分期可能出现降期，从而导致高复发风险直肠癌失去治愈机会。2010年2月—2011年8月我们应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测中低位直肠癌区域淋巴结角蛋白19（kretain19，K19）mRNA的表达情况，判断微转移情况及与临床病理的关系，探讨其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组共15例在我院行直肠癌根治术，肿瘤切除后立即取区域淋巴结及部分肿瘤组织，PBS清洗，淋巴结取一半液氮储存，另一半编号做常规病理。共127枚淋巴结，常规病理证实无转移。另取8枚淋巴结阳性及11枚良性疾病患者淋巴结作为对照。

1.2 RT-PCR检测K19 mRNA表达

1.2.1 引物合成 参照文献[1]选择K19及内参照引物。引物由上海生物化学细胞所合成。K19基因引物序列：K1 TTTGAGACGGAACAGGCTCT，K2 AATCCACCTCCACACTGACC。内参引物：R1 GTGACGTGGACATCCGCAAAG，R2 GGAAGGTGGACAGCGAGGC。

1.2.2 RNA提取 采用组织总RNA抽提试剂盒（华顺生物试剂公司）提取总RNA。淋巴结清洗后取50 mg组织研磨，加裂解液裂解，氯仿抽提，吸附柱吸附洗脱。总RNA溶解于30μL去离子水中，反转录合成cDNA。

1.2.3 PCR扩增 反应体系为20μL，包括cDNA 2μL，10×Buffer 2μL，4×dNTP 2μL，引物K1、K2、R1、R2各1μL，DNA聚合酶1 U，加水补足到20μL。94℃45 s，55℃40 s，72℃50 s扩增32循环，最后72℃延伸3 min。产物分析：取RT-PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，紫外检测仪观察结果。K19 mRNA扩增片段为460 bp，内参引物为211 bp。

2 结果

15例直肠癌组织样本中K19 mRNA表达均为阳性，另送8枚病理检查阳性直肠癌淋巴结组织中，K19 mRNA表达也均为阳性，良性疾病病人的11枚淋巴结表达均为阴性。127枚直肠癌常规病理组织学检查为阴性的淋巴结，RT-PCR检测出其中13枚K19 mRNA表达阳性（图1），存在微转移淋巴结分别属于5例患者。常规病理组织学检查漏诊率为10.2%（13/127）。其临床病理参数与微转移的相关关系见表1。

图1 直肠癌患者癌组织及淋巴结中K19 mRNA的RT-PCR结果

15例Duke B期中下段直肠癌患者均得到随访，随访时间22个月～40个月，所有病例均存活。5例伴有淋巴结微转移的直肠癌患者中，其中1例出现肝脏转移，1例局部复发，目前带瘤生存，而无微转移患者无1例复发转移。

3 讨论

淋巴结的转移与否，对大肠癌病情判断、估计预后和辅助治疗有重要价值。由于直肠的淋巴引流途径比结肠复杂，直肠癌术后更易发生复发转移，特别是局部复发[2]。中下段直肠癌在直肠癌中占多数，其淋巴结检出率要明显低于结肠癌。“无淋巴结转移”的Duke B期患者，有20%～30%患者5年内死于局部复发或远处转移，提示可能有微转移存在，而常规病理组织学检查及CT、MRI难以发现。

对微转移的研究近年来逐渐增多，RT-PCR是目前较为敏感的检测方法，可从107个单个核细胞中检测出1个肿瘤细胞[1，3]。K19属组织特异性标志物，主要分布在胃肠、乳腺、肺等上皮细胞。当这些细胞癌变后角蛋白组成不变，但含量升高，且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定，在正常淋巴组织中不表达[4-5]。本研究发现，良性疾病患者淋巴结均为K19 mRNA阴性，而K19 mRNA在直肠癌组织及有转移的淋巴结中均有表达，证明了其特异性、敏感性。本组病理HE染色阴性的127个淋巴结中，经RT-PCR证实13个淋巴结存在K19 mRNA阳性表达，说明存在肿瘤微转移灶，而常规病理组织学存在一定的淋巴结假阴性率10.2%（13/127），与其他研究报道类似[6]。

微转移可能是一个独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级，本研究中15例直肠癌随访情况，显示了有淋巴结微转移的患者有更高的复发转移风险。本研究发现淋巴结微转移与肿瘤的部位、大小有关，距肛缘7 cm以下，直径＞3 cm的肿瘤淋巴结微转移数增加，这与Märkl等[7]的结果一致。

表1 127枚淋巴结临床病理资料及微转移检测

本研究应用RT-PCR法扩增检测K19 mRNA，明显提高了区域淋巴结的转移诊断率，可使部分直肠癌病人分期升级，改变治疗策略，为患者及时进行术后辅助治疗及预后判断提供了依据。目前，K19 mRNA的RT-PCR检测主要尚用于研究和探索，今后需更多的样本量作进一步研究，为肿瘤转移诊断提供资料。

参与文献：

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