microRNA应用于前列腺癌诊断、治疗的研究进展

朱道宇，王尚乾，黄华兴，秦 超

1 miRNA的概述

miRNA是小型遗传保守性非编码RNAs，在细胞基本代谢、分化、增殖、存活、死亡的过程中扮演着基因表达调控因子的角色。

每个miRNA家族成员平均可以靶定500个不同基因，根据生物信息学分析，一个单基因的非翻译区3’UTR通常会被几个不同的miRNA所靶定[1]。另有三项研究报道miRNA可以通过直接结合到DNA完成其在转录水平的基因表达调控，这些数据说明了miRNA诱导的基因表达调控的复杂性和广泛性。因此，miRNA在将来应用于各种疾病特别是肿瘤的诊断与治疗是可行的。

2 miRNA应用于前列腺癌的诊断

2.1 前列腺癌的诊断现状 前列腺癌是当今西方诊断最为普遍的内源性肿瘤，也是男性第二大致死性恶性疾病。肿瘤的早期切除与放疗使得以前无法从PSA和前列腺指检筛查中获益的早期前列腺癌患者有了治愈的可能。同时，治疗前结合血浆PSA水平、前列腺活检、Gleason评分以及临床分期是当前预测前列腺癌预后的主要指标。但这些还不足以准确预测前列腺癌患者的预后转归，临床上需要更准确的诊断工具。

2.2 前列腺癌的新型诊断工具 第一个系统性描述前列腺癌中miRNA表达的报告发表于2007年，研究人员利用基因芯片技术检测到大量miRNA在前列腺癌与前列腺增生细胞间存在显著差异表达[2]。至今，已经有超过100篇文献报道了前列腺癌中miRNA的表达情况，许多研究者评估了miRNA的表达对于临床应用的价值后发现miRNA有望成为临床生物学标志。在前列腺癌未转移和已转移的两组患者中可筛查到667种血浆中miRNA的变化，总结为miRNA-141和miRNA-375应成为前列腺癌诊断和判断预后的有力工具[3]。同时在一项将25例转移性前列腺癌患者和25名年龄相仿的健康男性(对照组)中抽取血清进行对照试验后发现：miRNA-100、miRNA-125b、miRNA-141、miRNA-143及miRNA-296在前列腺癌患者的血清中表达增高，具有统计学意义。特别是miRNA-141被认为是最有效的前列腺癌生物学标志，其表达水平比正常对照组高46倍[4]。通过Illumina’s Human v2 miRNA 基因芯片技术对包含有25例前列腺癌患者和17例良性前列腺增生患者血清miRNA 进行筛查，结果显示：循环血清中miRNA 可作为诊断前列腺癌的生物标志，与单一miRNA 的作用相比，5种miRNA (let-7c，let-7e，miR-30c，miR-622，miR-1285) 的组套检查可以准确区分前列腺癌与前列腺增生，具有高敏感性与特异性[5]。类似的研究检测到miR-185、miR-16、let-7a和let-7b同样可以作为诊断前列腺癌的miRNA组套[6]。在运用Gleason评分系统对前列腺癌进行分析时，发现miRNA-182-5p的表达水平与肿瘤分级密切相关，可以作为评估肿瘤恶性程度的重要指标[7]。而高CAPRA评分的患者中发现miRNA-20a和miRNA-21显著升高，可用于区分患者危险性高低[8]。基于众多实验成果，近期针对前列腺癌设计出了一种全新的miRNA诊断试剂盒，它包括了众多先前已经被证实的miRNA[9]。因此，血清miRNA有望成为高效、敏感的生物学标志物，能够通过非侵袭性检查手段获得，并且能够克服蛋白质组学方法引起的抗体相关性的缺陷。

2.3 前列腺癌的预后判断工具 临床上局限性前列腺癌行根治术后的生存时间难以预测，其中30%的患者术后会伴有复发或转移。在一组对照试验中，将术前分期、分级以及PSA水平相当的患者纳为研究对象，令术后2年内复发与术后3年未复发的患者进行对比发现，未复发患者的血清miRNA-200a的水平较高，差异具有统计学意义。这说明miRNA-200a联合其他miRNA可能会作为前列腺癌复发的标志物[10]。在相似的研究[11]中检测到miRNA-21水平显著增高。在对139例前列腺癌组织进行研究时，发现miR-224阳性患者无进展生存期显著高于阴性患者[12]。而在发生转移的激素抵抗性前列腺癌患者，miRNA-375，miRNA-378和miRNA-141表达水平较未发生转移患者显著升高，同时miRNA-409-3p表达水平显著下降[13]。Sun等[14]则发现miRNA-211/-222数量升高，miRNA-23b/-27b数量下降。在另一组研究中，Watahiki等[15]检测到两组高度相关的miRNA，一组包括miRNA-141，miRNA-375和miRNA-200c，另一组为miRNA-151-3p，miRNA-423-3p，miRNA-126，miRNA-152和miRNA-21，以及一组相关度相对较小的miRNA-16和miRNA-205。从每一组各抽取1个RNA(miR-141，miR-151-3p和miR-16)可以作为检测发生转移的激素抵抗性前列腺癌的有力指标。以上结果均表明miRNA可以作为判断预后的重要工具。

3 miRNA对前列腺癌的干预功能

miRNA应用于肿瘤的新型干预方法也许是该领域中最令人鼓舞的方面。RNA基因谱的测序以及高度特异性的选择特点为肿瘤个体化治疗提供了依据。Catto等[16]提出miRNA可以逆转数百个基因的恶性表达并且影响多个关键通路。据推测，miRNA可能在肿瘤的原始位点与转移位点间的信号通路中发挥着关键作用。

3.1 对前列腺癌干细胞的影响 前列腺癌干细胞增加了细胞复制潜能，是细胞恶变、转移的开端，并且能够增加CD44+细胞株的能力，因此CD44被用作区分前列腺癌干细胞的标志物。Liu等[17]指出，miRNA-34a在CD44+前列腺癌细胞中表达下降，若通过转染等途径使其过表达则能显著抑制细胞恶性增生以及远处转移能力。另外，miRNA-34a拮抗剂在CD44+前列腺癌细胞中的表达增加了肿瘤的发生和转移的可能性。

肿瘤干细胞的出现可能是激素抵抗型前列腺癌产生的原因，现已证实let-7家族可能通过调节肿瘤干细胞对前列腺癌的复发与转移发挥重要作用[18]。Let-7家族的靶基因EZH2被证实具有调控肿瘤干细胞的功能。在该项研究中，let-7家族的缺失与相应的人类前列腺癌组织标本特别是在高Gleason评分的肿瘤组织中的EZH2的过表达相关。雄激素受体在前列腺癌中同样发挥着重要的作用，Qu等[19]研究表明miRNA-185可以通过靶定雄激素受体，抑制前列腺癌干细胞的增值与侵袭能力。

3.2 对前列腺癌上皮细胞间质转化的影响 上皮细胞间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤上皮细胞获得运动能力的重要机制。由于miRNA是控制EMT细胞信号通路的一部分，因此许多miRNA家族(miR-200，miR-205)在控制EMT中发挥了重要作用。在前列腺癌中，miRNA-143的上调表达抑制了间质化标志物vimentin 和 fibronectin的表达，并且增加了上皮化标志物E-cadherin的表达。miRNA-145的上调表达与miRNA-143具有相似的效果。miRNA-205可以通过与P63蛋白的相互作用抑制间质化标志物的表达。进一步研究则发现miRNA-205表达减少可以破坏前列腺基底膜的完整性，从而增加了前列腺癌转移的可能性[20]。

3.3 应用于前列腺癌治疗的可行性 随着科技的进步，现已合成了载体工具，可以将前体miRNA或抗RNA分子安全送入人体内部。这些小分子可以通过局部或全身给药的方式来诱导普遍意义上的细胞靶定。假如靶定过程是肿瘤特异性的，那么这些抗肿瘤分子将无害于正常细胞。Takeshita等[21]通过体外实验评估了miRNA应用于治疗泌尿系统肿瘤的可行性，在实验中，使用miRNA-16胶原共包埋的方式处理大鼠，逆转了前列腺癌的低度恶性表达并减慢了其扩散转移。Lee等[22]设计了利用单纯疱疹病毒I型(HSV-1)将miRNA-143/145起始序列融入到病毒特定基因中。这些miRNA在正常细胞中含量丰富但是在前列腺癌中却十分缺乏。因此，单纯疱疹病毒I型的前列腺癌特异性表达就会发生于那些缺乏抑制性miRNA的细胞中。在大鼠模型中，这种病毒减少了80%的肿瘤负荷。在另一组研究中发现，miRNA-27a的反义寡核苷酸可以作为潜在的治疗靶点，并可以通过抑制miRNA-27a的表达实现[23]。

目前研究设计出了miRNA的激动剂和拮抗剂来恢复或者阻断特定miRNA的功能，特异并且有效的miRNA拮抗剂成功的应用于体内，为基于miRNA治疗的措施开辟了道路[24]。但是miRNA的多基因靶定的特点使其难以驾驭，对正常基因的干扰以及临床应用的副反应等不得不慎重考虑。有研究机构已经找到了可以提高循环血中miRNA半衰期的方法，并且能够使得miRNA的跨膜转运变得相对容易，在今后的miRNA干预研究中可以利用这些研究成果转化为切实可行的临床治疗措施。

4 小结

miRNA应用于前列腺癌诊断和干预是当前的研究热点，此领域的探索已发现了大量与前列腺癌发生发展密切相关的miRNA及其作用靶点。目前该领域的研究进展很大程度上取决于miRNA高灵敏度及特异性的临床检测手段的开发和特意有效地将miRNA导入前列腺癌细胞内方法的建立。然而，人们对于miRNA应用于肿瘤治疗的知识仍然很局限，各实验室之间的数据不能很好的统一，并且未能发现与前列腺癌的发生发展有着必然联系的一种或一组miRNA，已发现的高相关度的miRNA大多还停留在实验室阶段。miRNA应用于前列腺癌的治疗也未取得重大突破，难以在临床上进行实践。因此，今后的研究应更加注重如何将miRNA的研究成果应用于临床上对前列腺癌患者的诊断、预后判断及治疗上。

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