脂肪间充质干细胞在脂肪组织工程中的研究现状

刘刚强， 刘 毅

综 述

脂肪间充质干细胞在脂肪组织工程中的研究现状

刘刚强， 刘 毅

脂肪移植; 脂肪组织工程; 脂肪间充质干细胞; 支架

脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells， ADSCs)是由PA Zuk等在2002年首先从脂肪组织中分离出的一种成纤维细胞样细胞，形态与骨髓间充质干细胞相似，可以向软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、神经细胞和脂肪细胞等不同胚层来源的细胞分化，具有自我更新能力和多向分化潜能[1]。因其具有来源充足、取材方便、无伦理争议的优势，近年来,作为脂肪组织工程的种子细胞受到研究者的广泛关注。笔者以ADSCs为种子细胞构建组织工程脂肪的研究进展作一综述。

1 ADSCs

ADSCs的分离多采用胶原酶消化离心的方法。供体的年龄、BMI、脂肪类型、取材部位、手术类型、培养条件、种植密度及培养基成分等因素对ADSCs的增殖与分化均有一定的影响[2]。Wu等[3]发现，随着年龄的增加，ADSCs的成脂分化能力略有所下降，但足以满足我们研究的需要。Russo等[4]比较不同取材部位ADSCs的活力、单克隆能力、倍增时间及成脂、成骨诱导能力，发现皮下及心包的脂肪分离的ADSCs能被更好的成脂诱导，而网膜脂肪分离的ADSCs能被更好的成骨诱导。胸部与腹部脂肪比较发现，胸部脂肪分离的ADSCs对成纤维细胞生长因子-2表达明显高于腹部，而成纤维细胞生长因子-2是血管生成的重要因子[5]。缺氧条件对血管化工程脂肪的构建也有明显的促进作用[6]。

1.1 ADSCs的生物学特性 ADSCs在倒置显微镜下可见为大而扁平的单层分布，细胞呈长梭形、星形、成纤维细胞形及不规则形。ADSCs在不同的条件下被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞，同时还具有向其他胚层细胞分化的能力[7]。目前，ADSCs达成共识的阳性表面分子包括：CD9，CD10，CD13，CD29，CD44，CD49e，CD51，CD55，CD59，CD90，CD166。阴性表达的表面分子包括：CD11a、b、c，CD14，CD16，CD18，CD31，CD45，CD50，CD56，CD104，HLA-DR。未达成共识的表面分子有CD34，CD49b，CD49d，CD54，CD61，CD62e，CD63，CD71，CD73，CD105，CD106，CD140a，CD146[8]。

1.2 ADSCs作为脂肪组织工程种子细胞的优越性 JM Gimble在2003年提出干细胞应用于临床必须遵守足够的细胞、最小的创伤、能通过常规可重复的方式向多系细胞分化、安全有效地自体移植或异体移植和产业化生产原则。ADSCs含量丰富，1 g脂肪能得到约1.0×106的ADSCs，在任何批号胎牛血清的DMEM中都能很好的增殖[9]；ADSCs与骨髓间充质干细胞具有相似的生物特性及多系分化能力，且较骨髓间充质干细胞不易受到肿瘤细胞的污染，更易进行体外净化[10]；ADSCs具有低免疫原性和免疫抑制作用，使其能够逃脱机体的免疫监视，有助于抑制异体移植的免疫排斥反应。研究发现，ADSCs的主要组织相容性复合物Ⅰ所产生的细胞因子，对脾细胞的免疫功能具有调节作用[11]。

1.3 ADSCs的成脂诱导分化 脂肪分化多认为经历多能干细胞-脂肪母细胞-前脂肪细胞-不成熟脂肪细胞-成熟脂肪细胞的过程。取生长良好的第4代细胞，用0.25%胰酶(含1 mmolEDTA)消化后，以2×107/L的浓度接种于预置多聚赖氨酸预处理盖玻片的6孔板内。细胞达80%以上融合时，加入成脂诱导液(含1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L胰岛素、100 mg/L吲哚美辛和体积分数10%胎牛血清)，3 d后换成脂维持液(含10 mg/L胰岛素的完全培养基)，24 h再换成脂诱导液，诱导2周后进行油红O染色鉴定诱导情况[12]。可以发现,ADSCs内有脂滴形成，并逐渐增多融合，诱导2周脂滴体积能占细胞体积的90%以上，将细胞核挤至一边，这种形态与成熟脂肪细胞非常相似，说明ADSCs已经分化为脂肪细胞。研究表明，胰岛素具有加强成脂转化因子表达的作用[13]。

1.4 ADSCs成脂分化的分子调控 成脂分化是一个复杂的过程，成脂转化因子包括PPARγ，SREBP-1c，C/EBPs。PPAR即过氧化物酶体增殖物活化受体，PPAR及PGC1基因家族有PPARA，PPARG，PPARD，PPARGC1A和PPARGC1B[14]。PPARγ是一种与脂肪细胞分化、脂类存储相关的核激素受体，在成脂分化过程中起关键作用，刺激增加各种相关基因的表达，而使ADSCs分泌因子(如肿瘤坏死因子，瘦素等)减少，脂联素的含量增加。PPARγ有3种亚型PPARγ1、PPARγ2及PPARγ3，γ1型可在不同组织细胞中低水平表达，γ2型存在于脂肪细胞中，γ3型仅在巨噬细胞和大肠中被发现。噻唑烷二酮类抗糖尿病治疗药物为外源性高亲和力配体。固醇调节元件结合蛋白(SREBP)是最先从小鼠的脂肪细胞里克隆出的一种转录因子，其脂肪生成酶的基因表达，对于脂质稳定性有很重要的作用，但目前SREBP的脂肪形成机制及与PPARγ的关系尚不明确。C/EBPs是CCTTA增强子结合蛋白，属DNA结合区b-zip家族中的一种，分子中有一个亮氨酸拉链样结构的二聚体。在脂肪细胞及诱导成脂的细胞早期高表达C/EBPs的亚结构，前脂肪细胞转变成脂肪细胞的过程中C/EBPs有很重要的作用，但在成熟的脂肪细胞中C/EBPs含量较少[15]。在PPARγ的基因启动区可能包含有C/EBPs的位点，随着PPARγ基因启动，C/EBPs也伴随着表达。PPARγ与C/EBPs联合对ADSCs的成脂分化有很强的促进作用[16]。相反，脂肪结合蛋白4(FABP4)是一种存在于胞质的脂肪酸分子伴侣，对PPARγ的表达及成脂分化有抑制作用[17]。

2 ADSCs与支架材料

构建脂肪组织工程理想的支架材料应具备良好的机械性能、生物降解性、生物相容性、低免疫原性、促血管化性等特点。用于构建脂肪组织工程的支架材料主要分为天然材料和人工合成材料，目前常用的主要支架材料有胶原蛋白、透明质酸、丝素蛋白、壳聚糖、藻朊酸盐、PLGA、富含血小板血浆、脱细胞基质等[18]。为探索出更加适宜的脂肪组织工程支架，近年来研究人员进行了多方面的尝试。迄今为止，人们发现的胶原蛋白有19种，从动物的皮肤或跟腱中提取的Ⅰ型胶原蛋白在脂肪组织工程中运用较多，对于细胞黏附、诱导分化有很好的促进作用，其生物相容性好，降解速度可调，是一类良好的可引导组织再生的生物材料，Itoi等[19]以Ⅰ型胶原海绵、非纺PLGA和透明质酸凝胶为支架进行对比实验研究，结果表明，在这3种支架中,Ⅰ型胶原海绵更适合作ADSCs构建脂肪组织工程的支架。Rose等[20]对胶原蛋白联合壳聚糖并加入0.2%芦荟汁所构成的支架材料的研究发现，胶原蛋白支架加入芦荟汁组细胞增殖能力强于单纯胶原蛋白-壳聚糖支架组，更明显强于单纯细胞培养增殖。Girandon等[21]将ADSCs种植于不同的3D天然支架材料，比较藻酸盐、纤维蛋白凝胶和胶原海绵等支架所构建的工程脂肪，发现纤维蛋白凝胶组产生的新组织在机械性能、脂化程度、细胞活性及VEGF表达方面均高于其他各组。

透明质酸是一种糖胺聚糖，广泛分布在动物和人体组织及细胞外基质中，有很多亲水集团，具有很强保存水分的能力。近年来,透明质酸在脂肪组织工程中的应用研究取得重要进展[22]。其作为生物支架复合ADSCs可加速软组织血管化的形成[23]。透明质酸及壳聚糖也常与其他材料联合作为脂肪组织工程的支架材料[24]。丝素蛋白是一种天然的高分子聚合物，其低免疫原性，良好的生物相容性，缓慢的降解速度及稳定的机械性能等特性使其成为一种新型的生物支架材料[25]。近年来,通过制备方法的改进，表面分子修饰等技术对丝素蛋白性能的改变，丝素蛋白支架都被广泛运用于各组织工程领域，包括骨、血管、神经、软骨、韧带、肌腱、心脏、眼和膀胱组织工程等[26]。藻朊酸是一种天然生物材料，已被普遍用作组织工程支架材料，其可塑性好，具有突出的生物相容性和低免疫排斥反应等特点。藻朊酸常作为用于构建三维的组织工程脂肪的支架材料[27]。聚乳酸-聚羟基乙酸共聚体、聚乳酸和聚羟基乙酸同属于人工合成的聚合物，已获得美国FDA批准，被广泛用于组织工程领域的研究。聚乳酸-聚羟基乙酸共聚体被制作成直径为100～250 μm的微球支架，与干细胞联合后可直接注射在移植部位，对受体所造成的伤害很小，具有广阔的应用前景[28]。水溶性聚乳酸-聚羟基乙酸共聚体与壳聚糖交联的多孔支架运用于脂肪组织工程取得较好的效果[29]。其他人工合成的聚合物还有：聚己内酰胺、聚乙烯乙二、聚氨基甲酸乙酯等[30]。富含血小板血浆可来源于自体的血小板浓缩，其最大特点是含有大量的血小板、多种高浓度生长因子及丰富的纤维蛋白，因其制备简便、价格低廉和无免疫原性的特点，常被用于脂肪组织工程的支架材料中[31]。富含血小板血浆能作为自体材料应用于脂肪组织工程，可促进ADSCs增殖和成脂分化[32]。脱细胞基质支架是由细胞外基质构成的生物支架，近年来广泛应用于脂肪组织工程[33]，脱细胞基质可以从脂肪组织或大网膜通过一系列的物理、化学及酶促反应获得，细胞的移除并没有明显的影响脱细胞基质的形态和结构，脱细胞基质含有胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和黏多糖等多种生物活性分子，具有促进细胞聚集、调节细胞活动以及防护支持作用，且无明显的免疫反应，脱细胞基质还具有良好的机械性能，可以制作出不同3D形状的脂肪组织工程支架[34]。细胞外基质可以与脂肪间充质干细胞膜受体相互作用，促进成脂诱导[35]。脱细胞脂肪内有交叉排列的甲基丙烯酸乙二醇壳聚糖或甲基丙烯酸硫酸软骨素，结构稳定，湿度为5%的脱细胞脂肪联合水凝胶支架对脂肪形成有明显的促进作用[36]。

3 ADSCs与生物分子

脂肪组织工程的构建除种子细胞和支架材料外，细胞生长的微环境也对成功构建工程脂肪有重要的作用。多种蛋白分子可以促进ADSCs增殖，如碱性成纤维生长因子2、血小板生长因子、转化生长因子1。抗氧化剂和低钙培养基也能提升ADSCs的生长速度和活力。组织工程脂肪移植入活体内早期不能很好地建立血液供应系统，大量脂肪堆集在一起，会因供血不足导致脂肪细胞溶解、吸收、坏死，且易引发感染、血肿、硬结、囊肿、坏死等并发症发生，多种促血管生长因子被用于脂肪组织工程的构建，如内皮生长因子、血管内皮生长因子、动力增益因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和脑源性神经营养因子等；内皮生长因子和碱性成纤维生长因子不仅可以促进ADSCs增殖能力，对ADSCs成脂分化有一定的促进作用[37]。血管内皮生长因子165和碱性成纤维细胞生长因子的暂时过度表达可建立有效的血管网，从而促进组织工程脂肪的存活[38]。肝细胞生长因子在促进工程脂肪血管化方面也有明显的效果[39]。另外，内皮生长因子对ADSCs分泌促血管化激素有很强的刺激作用，这种刺激作用主要通过细胞外调节激酶和氨基端激酶途径实现[40]。ADSCs也可通过旁分泌作用分泌出多种生长因子促进自身及周围细胞的增殖[41]，也可分泌多种细胞因子，如FLT-3受体，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，白细胞介素6、7、8、11，肿瘤坏死[42]。在缺氧条件下，这些因子的表达明显增加[43]。ADSCs注入体内后分布示踪的研究中发现，在缺血组织及周围分布增多，8周后可有微血管形成[44]，说明ADSCs本身亦有促进血管形成的作用。

4 存在的问题与展望

目前，ADSCs构建工程脂肪的方法可归纳为4类：①利用支架材料引导组织再生构建工程脂肪，即将ADSCs种植在可吸收的支架上，再植入体内，细胞分化的同时支架材料降解吸收，从而形成所需的脂肪组织；②可注射的复合材料构建工程脂肪技术；③利用富含血管的大网膜组织或脂肪基质支架构建的脂肪组织工程，以便利用固有的血管建立血管化脂肪组织；④携带生长因子促进脂肪组织再生及微血管建立的脂肪工程技术。组织工程化脂肪应用于临床治疗主要有两种方案：一种为体外将种子细胞接种于支架上进行成脂诱导，然后再移植于体内；另一种将种子细胞与生物材料复合物直接移植到体内，再进行体内诱导成脂分化。对于ADSCs的研究目前虽然取得了很大的成就，但真正应用于临床还有很多问题尚未解决，如何在体内、外控制增殖分化的进程？控制进程的因子有哪些？虽说ADSCs较安全，但ADSCs长期致病性的问题，能否找到一种ADSCs特征性标志分子，以便在实验中分离与鉴定ADSCs，控制ADSCs的纯度与移植数量？ADSCs增殖与分化、细胞间相互作用的分子机制仍不清[45]。脂肪组织提取细胞前的准备、ADSCs扩增与维持的技术、所需细胞的纯度、ADSCs数量的测定、体外多向分化潜能的检测等尚无统一标准。尽管存在以上问题，但ADSCs仍然是目前构建组织工程脂肪最适宜的种子细胞，随着对ADSCs认识的不断深入及支架材料不断改进，相信脂肪组织工程终将会成为解决大面积软组织缺损的重要方法。

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730050 甘肃 兰州，兰州大学第二临床医学院(刘刚强)；兰州军区兰州总医院 全军烧伤整形外科中心(刘 毅)

刘刚强(1985-)，男，甘肃天水人，硕士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.11.015

2014-09-12)