牛凝乳酶原基因在食品级乳酸乳球菌中的重组表达

张艳丽，聂春明，周利伟，张 伟，张宇宏,*，杨晓红*

（1.南方山地园艺学教育部重点实验室，西南大学园艺园林学院，重庆 400715；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

牛凝乳酶原基因在食品级乳酸乳球菌中的重组表达

张艳丽1,2，聂春明2，周利伟2，张 伟2，张宇宏2,*，杨晓红1,*

（1.南方山地园艺学教育部重点实验室，西南大学园艺园林学院，重庆 400715；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

将牛凝乳酶原基因连接pNZ8149载体，并转化乳酸乳球菌NZ3900，经乳酸链球菌素Nisin诱导，测得重组菌株胞内凝乳酶活力达到0.7 SU/mL，培养基中检测不到凝乳酶活力，实现了牛凝乳酶原基因在乳酸链球菌Nisin诱导基因表达系统（nisin controlled gene expression system，NICE）中活性表达。在此基础上，将分泌信号肽SPusp45连接于pNZ8149，构建了分泌型表达载体pNZ8149s，并实现牛凝乳酶原基因在NICE系统中分泌表达。当使用1 ng/mL Nisin诱导5 h后，重组菌株胞内检测不到凝乳酶活力，培养基中凝乳酶活力为1.2 SU/mL，说明pNZ8149s能够促使凝乳酶原从乳酸乳球菌中分泌。该方法为重组牛凝乳酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案。

凝乳酶；乳酸乳球菌；食品级；表达

牛凝乳酶（EC3.4.23.4，bovine prochymosin）是从未断奶小牛皱胃中提取出的一种天冬氨酸蛋白酶，其在酸性条件下能够自行剪切N端的42个氨基酸从而形成有活性的凝乳酶[1]。该酶可以专一性裂解κ-酪蛋白中的Phe105-Met106肽键，引起乳蛋白凝聚，在乳制品特别是干酪加工中具有重要作用，对干酪的品质和特有风味起着决定性的作用[2-4]。近年来，由于世界干酪产量剧增，小牛皱胃提取的凝乳酶无法满足需求。国内外凝乳酶的开发主要集中在新型酶源的开发和多种重组表达系统的利用两个方面。新型的多种来源凝乳酶的开发利用，例如植物源凝乳酶[5]和微生物源凝乳酶[6]已作为替代品应用于干酪生产中，但存在着专一性不强、蛋白水解能力高、在乳中残留量高等缺点，而且可导致加工的成熟干酪出现苦味或其他不良风味[7-8]。随着基因工程技术的发展，利用重组DNA技术以微生物为宿主生产重组牛凝乳酶是解决需求增加和来源受限的有效途径之一，已经有牛凝乳酶基因在大肠杆菌、毕赤酵母等微生物中重组表达的报道。例如在1983年Beppu等[9]首次利用Escherichia coli生产凝乳酶，但是产物以包涵体的形式累积在胞内。之后，冯镇等[10]克隆了小牛凝乳酶基因并在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中进行了分泌表达。也有研究者用毕赤酵母（Pichia pastoris）[11]或构巢曲霉（Aspergillus nidulans）[12]成功表达了有活性的牛凝乳酶。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）早已被人类用来生产泡菜、奶酪、酱油和酸奶，因而是公认的食品级安全微生物（generally regarded as safe，GRAS），符合美国食品药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）要求而日益受到重视。虽然其基因转录和翻译的调控及蛋白质分泌的机制还不是非常清晰，且该表达系统分子遗传学研究晚于大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等表达系统。但是近些年，随着乳酸菌各类表达调控元件的分离和基因组的测序，以乳酸乳球菌作为异源蛋白的宿主菌株，逐渐成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点[13]。一些异源蛋白[14]、细胞因子[15]等在乳酸乳球菌中得以成功表达。其中的乳酸乳球菌Nisin诱导基因表达系统（nisin controlled gene expression system，NICE）因其诱导剂、筛选物和宿主菌株均为食品级，符合FDA安全标准，是乳酸乳球菌中应用最广的异源蛋白表达系统[16-17]。本实验将牛凝乳酶原基因在NICE系统中进行胞内重组表达，并构建分泌型表达载体pNZ8149s，将牛凝乳酶原分泌至培养基中从而有利于后期纯化，诱导酶液经组氨酸标签镍离子亲和层析纯化，并使用Western blotting鉴定目标蛋白。研究结果为生产食品级重组牛凝乳酶提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ3900、pNZ8149载体 德国Mobitec公司；pEASY-T1 simple、大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞 北京全式金生物技术有限公司。

1.2 试剂与培养基

M17 broth、EM培养基、NZ3900感受态制备培养基和孵育液、蛋白胨、酵母膏 英国Oxoid公司；Taq DNA聚合酶、DNA纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒 天根生化技术（北京）有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶 加拿大Fermentas公司；基因和引物合成 北京奥科鼎盛生物科技有限公司；鼠抗His-Tag单克隆抗体和碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG抗体 康为世纪公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 牛凝乳酶原基因的克隆

根据G e n B a n k公布的牛凝乳酶原基因序列（Accession No. FJ768675.1），在其3’端添加组氨酸标签（His-Tag）序列，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成目的基因，命名为pcm，该基因连接于pGH载体得到重组质粒PGH-pcm。以PGH-pcm质粒为模板，8p-Nco-f（5’-CTGCCATGGGTGCTGAGATTACCAGAATCCCT CTG-3’，下划线为Nco I 酶切位点）和8p-Sac-r（5’-CTT TGAGCTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3’，下划线为Sac I 酶切位点）为引物进行PCR。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s、57 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s，30循环；72 ℃延伸10 min。回收目的片段并连接到pEASY-T1 simple载体转化入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中。蓝白斑筛选重组质粒并测序，测序正确的质粒命名为pT-pcm。

1.3.2 重组表达载体的构建

pT-pcm质粒及pNZ8149质粒（图1a）用Nco I和Sac I进行双酶切，回收目的片段后用T4 DNA连接酶连接（22 ℃连接3 h），乙醇沉淀浓缩后电击转化至乳酸乳球菌NZ3900，挑取阳性克隆并提取质粒，质粒经Nco I / Sac I双酶切和测序鉴定，正确的重组载体命名为pNZ8149-pcm（图1b）。

图1 重组载体构建示意图Fig.1 Construction of recombinant vectors

1.3.3 分泌型重组表达载体的构建

将合成的信号肽序列SPusp45（Accession No.M60178.1，北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成），连接于pGH载体得到pGH-SPusp45。按照1.3.2节所述方法将SPusp45连接到pNZ8149，并获得正确的载体pNZ8149s（图1b）。

利用 EcoR I和Not I将pcm基因从pGH-pcm酶切并连接到分泌性表达载体pNZ8149s，按照1.3.2节所述方法获得正确重组载体pNZ8149s-pcm（图1b）。

1.3.4 乳酸乳球菌感受态细胞制备和转化

按照Mobitec公司提供的NICE操作手册制备L. lactis NZ3900电击感受态细胞，分装50 μL/支并贮存于－70 ℃冰箱。取5 μL乙醇沉淀并溶解的连接产物加入刚融化的NZ3900感受态细胞中并混匀，置于冰上5 min。Bio-Rad电击仪转化，电击条件为2 kV、25 μF、200 Ω。电击结束后迅速加入1 mL孵育液，冰浴5 min后30 ℃静置培养1～1.5 h。取适量菌液涂布于EM平板，30 ℃培养1～2 d直至黄色菌落长出。含有pNZ8149-pcm质粒的重组菌株命名为L9P，含有pNZ8149s-pcm质粒的重组菌株命名为L9sP。使用同样条件转化空载体pNZ8149及pNZ8149s质粒并于EM平板上进行培养，菌株分别命名为L9、L9s，作为空载体阴性对照。

1.3.5 重组牛凝乳酶原的诱导表达

分别将L9、L9s、L9P和L9sP这4种菌株在LM17液体培养基中30 ℃静置培养过夜，然后按2%接种量转入新鲜LM17培养基中，培养至OD600nm为0.4时分别加入终质量浓度为1 ng/mL的乳链菌素Nisin，继续在30 ℃诱导培养5 h。以不添加Nisin的菌液作为未诱导的阴性对照。培养结束后10 000 r/min室温离心5 min，分别收集培养基上清和菌体。培养基上清直接用于测定胞外凝乳酶活力；菌体细胞采用液氮研磨法破碎，再用pH 5.5的0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液重悬，用于测定胞内凝乳酶活力。

1.3.6 凝乳酶酶活力的测定

酶原激活：收集的酶液用1 mol/L HCl调整至pH 2.0，室温下（25 ℃）放置2 h，然后用2 mol/L NaOH将其pH值调至pH5.5。

依据改进的Arima等[18]的方法进行凝乳酶活力的测定。用0.01 mol/L CaCl2溶液配制10 g/100 mL脱脂乳，此溶液配制后在室温下放置40 min后使用。取1 mL 10 g/100 mL脱脂乳于32 ℃保温10 min，加入适量稀释的酶液（未激活的酶液作为对照），振荡均匀并开始计时，观察管壁上开始出现凝乳颗粒为终点，记录凝乳时间t/s。在上述条件下，40 min凝结1 mL 10 g/100 mL脱脂乳所需的酶量定义为一个Soxhlet单位（SU）。

式中：d为酶液稀释的倍数。

同样条件下，在离心管中进行上述凝乳反应。反应5 h后，倒置离心管，观察脱脂乳的凝结情况。

1.3.7 重组菌株L9sP诱导条件的优化

按照1.3.5节方法对L9sP进行诱导表达，将Nisin终质量浓度分别设定为0.1、1、5、10、100、1000、10000 ng/mL，分别在诱导时长为1、3、5、9 、20 h（将加入Nisin的时刻记为0 h），取样测定菌体生长情况和培养基中的凝乳酶活力。

1.3.8 重组牛凝乳酶的纯化与鉴定

在最佳诱导条件下，对4种菌株L9、L9s、L9P和L9sP进行诱导培养，收集胞内和胞外酶液。并且L9sP的胞外诱导酶液酸化激活后，利用组氨酸标签（His-Tag）镍离子亲和层析进行纯化，通过Western blotting鉴定4种菌株中重组牛凝乳酶原的表达和纯化情况。一抗为鼠抗His-Tag单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG抗体。

2 结果与分析

2.1 分泌型载体及重组质粒的构建

图2 重组表达载体的构建和鉴定Fig.2 Construction and identification of recombinant vectors

质粒pT-pcm和pGH-SPusp45经过双酶切后，分别回收1.1 kb 和150 bp的目的片段，连接pNZ8149并电击转化NZ3900感受态细胞。质粒pGH-pcm经双酶切后回收1.1 kb的目的片段，连接pNZ8149s并电击转化NZ3900感受态细胞。含有重组质粒的阳性菌落在EM平板上呈黄色（图2a）。提取重组质粒并通过双酶切（图2b）和测序鉴定表明，分泌性载体pNZ8149s、重组载体pNZ8149-pcm和pNZ8149s-pcm均构建成功。

2.2 重组牛凝乳酶的凝乳活力

分别对L9、L9P、L9s和L9sP菌株进行诱导表达，并得到胞内和胞外诱导酶液，然后分别测定各个样品的凝乳酶活力。如图3所示，含空载体的菌株L9和L9s其胞内和胞外产物均无凝乳活力。重组菌株L9P的凝乳活力集中于胞内，而含有pNZ8149s-pcm的重组菌株L9sP其凝乳活力集中于胞外产物。说明牛凝乳酶原基因pcm连接pNZ81 49载体后可在乳酸乳球菌中成功表达，但并未分泌至培养基中。而分泌型pNZ8149s载体，能够实现牛凝乳酶原基因pcm在乳酸乳球菌中的分泌表达。

图3 重组牛凝乳酶活性检测Fig.3 Determination of recombinant chymosin activity

2.3 L9sP中重组凝乳酶原诱导条件的优化

图4 Nisin质量浓度对菌体生长和重组牛凝乳酶活力的影响Fig.4 Effect of nisin concentration on strain growth and recombinant chymosin activity

在食品级表达系统NICE中， Nisin可诱导重组蛋白的产生，但是高质量浓度的Nisin对菌体生长有一定的抑制作用[19]。如图4a所示，当培养基中Nisin终质量浓度低于10 ng/mL时，对菌体生长无显著影响；Nisin终质量浓度达到100 ng/mL时，菌体生长速度减慢；当高于1 000 ng/mL时，菌体生长几乎完全受到抑制。同样，诱导时间对目标蛋白的表达影响也比较显著。如图4b所示，随着诱导时间的延长，凝乳酶活力随之增加，5 h时达到最高，随后缓慢下降。但当Nisin高于100 ng/mL时，凝乳酶活力较低，且并未随时间延长而增加。可能是由于高质量浓度的Nisin抑制了菌株的生长和代谢所致。当Nisin终质量浓度为1 ng/mL时，凝乳酶活力最高，诱导5 h后凝乳酶活力达1.2 SU/mL。由此确认最佳诱导条件为终质量浓度1 ng/mL的Nisin，诱导时间5 h。

2.4 重组牛凝乳酶的鉴定

由图5Western blotting结果可知，与L9、L9s及未经Nisin诱导的L9P和L9sP相比，只有重组菌株L9P胞内产物和L9sP胞外产物能够观察到特异性条带，分子质量约为37 kD和43 kD，分别与牛凝乳酶和牛凝乳酶原蛋白理论分子质量相符。同时出现两种蛋白条带的原因可能是在诱导过程中，重组菌株产酸会导致一部分重组牛凝乳酶原（43 kD，泳道P上方箭头所示）自我剪切形成重组牛凝乳酶（37 kD，泳道P下方箭头所示）。L9sP菌株培养基中的蛋白经酸化后进行亲和层析纯化，纯化产物在Western blotti ng图中显示单一条带（泳道P下方箭头所示），且其分子质量大小与L9sP粗酶液中的重组牛凝乳酶（37 kD）相符（图5）。以上结果进一步说明重组菌株L9P和L9sP经Nisin诱导后，能够表达重组牛凝乳酶原，并且L9sP中牛凝乳酶原可分泌至胞外，这表明本研究构建的pNZ8149s可实现目标蛋白的分泌。

图5 菌株中重组牛凝乳酶的Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of the recombinant chymosin in different strains

3 讨论与结论

由于凝乳酶的特殊用途，选用安全型、食品级的重组表达系统显得尤为重要。所以用于生产重组凝乳酶的表达体系包括载体、宿主菌、选择标记以及诱导物都必须是食品安全级别的[20]。而乳酸乳球菌的NICE表达系统是一种典型的食品级可控表达系统，其诱导剂、筛选物和宿主均符合食用安全的要求。此外此系统还具有安全性、无内毒素、表达调控严谨和高效性等优点，是理想的异源蛋白表达体系[21]。本研究构建的生产重组牛凝乳酶原的乳酸乳球菌，为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。

孙大庆等[22]利用乳酸乳球菌L. lactis NZ9000和表达载体pNZ8148成功表达了牛凝乳酶原，重组牛凝乳酶在重组菌株胞内表达。受此启发，本研究成功构建了牛凝乳酶原乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-pcm，在菌体胞内表达出有活性的重组牛凝乳酶，但重组蛋白难以分泌至胞外，易被当做外源入侵物而被细胞内水解酶系统水解[23]，同时，也不利于后期目标蛋白的纯化。有文献表明利用乳酸菌usp45基因的分泌信号序列SPusp45，在乳酸乳球菌中可帮助外源α-淀粉酶成功分泌至胞外[24]。本研究将信号肽SPusp45融合到pNZ8149载体的PnisA启动子下游，构建了分泌型表达载体pNZ8149s，并进一步构建了牛凝乳酶原乳酸乳球菌分泌表达载体pNZ8149s-pcm，并在培养基上清中成功检测到了凝乳活性，说明本研究构建的pNZ8149s可以作为分泌型表达载体，且实现了牛凝乳酶原的分泌型表达。

孙大庆等[22]提出将产凝乳酶的乳球菌直接用于奶酪的加工，使乳酸乳球菌既发挥原有的发酵作用又可以在奶酪加工的凝乳阶段产生适量的凝乳酶，即发酵和凝乳角色合二为一，那么将对奶酪生产更加具有意义。本研究构建的食品级分泌型重组菌株符合发酵和凝乳功能融合的要求，但是达不到奶酪工业生产中凝乳酶量的要求（0.2 mg凝乳酶/L原料乳）。虽然本研究对摇瓶的诱导条件进行了优化，但凝乳酶原的表达量仍然很低，主要原因可能是本研究使用的牛凝乳酶原基因序列为小牛来源的原始序列，不适应乳酸乳球菌中的密码子偏好性，因此导致牛凝乳酶原表达量偏低。根据文献报道，Şimşek等[25-26]通过提高培养基中的氮源、碳源含量和改善培养条件，提高了Nisin蛋白的表达量。Kong等[27]通过密码子优化II型猪圆环病毒的衣壳蛋白基因，也提高了基因在乳酸乳球菌中的表达水平。Ng等[28]通过改变信号肽SPusp45的mRNA二级结构和突变了其中一些氨基酸，使得目标蛋白的分泌量都有所增加。因此，提高外源蛋白在乳酸乳球菌中表达量可通过改善发酵条件、目的蛋白密码子优化及信号肽改造等途径。目前，我们正在通过多种策略来提高牛凝乳酶原的表达量，使乳酸菌发酵和凝乳双重功能合二为一成为可能。本研究为食品级发酵生产重组牛凝乳酶提供了新思路和新方法。同时，也为乳酸菌分泌表达外源蛋白提供了可行性方案。

重组表达凝乳酶是弥补奶酪行业所缺凝乳酶的重要途径之一。本实验利用食品级表达系统NICE成功表达了牛凝乳酶原基因，进一步通过经改造的分泌型表达载体pNZ8149s实现了牛凝乳酶原的分泌表达，培养基中凝乳酶活力可达1.2 SU/mL。

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Recombinant Expression of the Bovine Prochymosin Gene in Food-Grade Lactococcus lactis

ZHANG Yan-li1,2, NIE Chun-ming2, ZHOU Li-wei2, ZHANG Wei2, ZHANG Yu-hong2,*, YANG Xiao-hong1,*
(1. Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

In this study, we cloned the bovine prochymosin gene pcm into the expression vector pNZ8149 and transformed into Lactococcus lactis NZ3900. The intracellular chymosin activity attained 0.7 SU/mL in the presence of nisin induction, suggesting that the bovine chymosin gene was successfully expressed in the food-grade nisin controlled gene expression system (NICE). Furthermore, the secretion signal SPusp45 was ligated into pNZ8149 to generate pNZ8149s. Recombinant L. lactis containing pNZ8149s-pcm showed a chymosin activity of 1.2 SU/mL in culture supernatant after induction by 1 ng/mL nisin for 5 h. This result demonstrated that bovine chymosin could be secreted by the expression vector pNZ8149s. This study provides a feasible method for producing recombinant bovine chymosin in food-grade strains.

chymosin; Lactococcus lactis; food-grade strain; expression

Q812

A

1002-6630（2014）07-0123-05

10.7506/spkx1002-6630-201407025

2013-04-11

中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（2013-05）

张艳丽（1987—），女，硕士研究生，研究方向为应用微生物。E-mail：zyl_18651@126.com

*通信作者：张宇宏（1980—），男，副研究员，博士，研究方向为微生物基因工程。E-mail：zhangyuhong@caas.cn

杨晓红（1963—），女，教授，博士，研究方向为应用微生物。E-mail：yangxh2@swu.edu.cn