底物浓度对餐厨废弃物与牛粪混合产氢发酵的影响

李文哲，殷丽丽，王明，刘爽，刘丹，李晶宇

（东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030）

底物浓度对餐厨废弃物与牛粪混合产氢发酵的影响

李文哲，殷丽丽，王明，刘爽，刘丹，李晶宇

（东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030）

文章探讨餐厨废弃物与牛粪混合厌氧发酵产氢时，底物浓度对发酵系统产氢率的影响，以餐厨废弃物与牛粪1∶1（TS/TS）混合作为厌氧发酵底物，在温度为（35±1）℃条件下，进行批式厌氧发酵产氢试验。考查底物浓度对餐厨废弃物与牛粪混合产氢发酵时挥发性固体产氢率、pH、液相末端产物等影响。结果表明，当底物浓度为80 g·L-1时，挥发性固体产氢率达到最大值为31.05 mL·g-1，累积产氢量为672 mL，此时挥发性固体去除率最大为29.34%。厌氧发酵体系pH在5.48～5.81范围内，乙酸和丁酸为主要的液相末端产物，可用作后续产甲烷厌氧发酵底物。

氢气；牛粪；餐厨废弃物；厌氧发酵

餐厨废弃物为城市有机生活垃圾的主要组成成分，其富含碳水化合物，同时含有蛋白质、脂类、无机盐和少量氮、磷、钾、钙、钠、镁、铁等微量元素，易于降解，是一种理想的厌氧发酵原料[1-3]。利用厌氧发酵技术，能同时实现有机废弃物的减量化、能源化和资源化，是处理餐厨废弃物和畜禽粪便的有效手段[4-6]。厌氧发酵过程在降解有机废弃物的同时还会伴有大量混合气体产生，主要有氢气、甲烷、氮气、二氧化碳和硫化氢等。其中氢气和甲烷可作为二次能源。通过人为调控的厌氧发酵技术可有效产生大量氢气，但不同于产甲烷发酵，产氢发酵对底物营养成分有严格要求，需要淀粉、脂肪和蛋白含量较高而纤维类物质含量较低的原材料作为产氢发酵底物，如餐厨废弃物。餐厨废弃物不仅作为厌氧发酵产氢底物[7]，而且其流出液可继续被用来进行产甲烷发酵，实现原料开发利用最大化。影响餐厨废弃物厌氧发酵产氢因素有基质营养比例、pH、温度、水力停留时间和底物浓度等[8-10]。其中，基质营养比例和底物浓度是影响产氢发酵重要因素[11-12]。底物浓度是影响厌氧发酵的重要因素之一，浓度过低，不利于微生物繁殖，发酵体系容积负荷过低，减少容积产气率，降低体系利用率；底物浓度过高，增大传质阻力，不利于微生物与原料接触，氨、重金属、挥发性有机酸等抑制物浓度随之升高，影响厌氧微生物活性。另外，底物浓度过高会给搅拌过程带来困难。所以，适宜的底物浓度不仅有助于细菌活动，而且还会降低物质在发酵液中的传质阻力。本研究以牛粪与餐厨废弃物按1∶1（TS/TS）混合作为底物，探讨不同底物浓度对厌氧发酵产氢过程影响，以期获得最大VS产氢率和有效容积产氢率下最佳厌氧发酵底物浓度。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用牛粪取自东北农业大学香坊实验实习基地。餐厨废弃物收集于某高校学生餐厅，主要由馒头、米饭、蔬菜、肉类等组成。取回后，首先挑拣出木牙签、纸杯、塑料杯（袋）、骨头等杂物，然后用食物粉碎机粉碎，装入塑料瓶中，放入4℃冷柜中保存备用。厌氧发酵产氢所用接种物取自东北农业大学生物质能工程技术研发中心的产甲烷反应器[反应器参数为：罐体积：500 L；有效容积：400 L；消化底物：牛粪；TS：6%～8%；容积产气率：1～1.5 m3·d-1；底物VS产甲烷率：180～220 L·kg-1；水力停留时间：20 d；连续运行100 d以上，运行温度为：（35±1）℃]的流出液，取回后放入4℃冰箱内保存待用。本试验所用产氢接种物来自本试验所用沼液，经过一定预处理得到。首先将沼液装入3 L锥形瓶中放入4℃冷柜静止，1个星期后取出锥形瓶，将瓶内悬浮液倾倒入另一个锥形瓶中并将原锥形瓶中沉淀物弃去。再将装有悬浮液的锥形瓶放入100℃沸水浴加热30 min，其目的是杀灭产甲烷菌，富集产氢细菌。待锥形瓶冷却至室温，放入4℃冷柜中保存备用。以上物料理化参数见表1，每个样品重复测量3次，结果取平均值。

1.2 试验设计

厌氧发酵产氢采用批式试验设计，以500 mL锥形瓶作为反应器，有效容积为400 mL，牛粪与餐厨废弃物按1∶1（TS/TS）混合作为产氢发酵底物。该试验共设置10组处理，每组物料配比如表2所示，牛粪和餐厨废弃物的添加量由3.2 g逐渐增加到32 g，而每组接种物添加量均为80 g，然后用自来水补齐到工作体积为止。厌氧消化温度为中温发酵，即（35±1）℃，恒温摇床振荡频率为150 r·min-1条件下培养至所有处理组停止产气为止。每个处理做3个平行，结果取平均值。

1.3 分析方法

TS、VS采用电热鼓风干燥箱、箱式电阻炉，并根据标准方法测定[13]。

表1 底物及接种物的性质Table 1 Characteristics of substrates and inoculum

表2 每个处理的物料组成Table 2 Composition of each treatment

总固体含量（Total solids，TS）又称为蒸发总残留物，主要包括溶解性和不溶性固体，通常是将待测样在一定温度下烘干一段时间至恒重时剩余的物质即为总固体。挥发性固体含量（Volatile solids，VS）是指总固体（TS）中能在550℃高温下充分挥发的那部分物质，而高温灼烧后的残余物称为灰分。因此，挥发性固体（VS）含量等于总固体含量减去灰分。

总固体含量（TS）、挥发性固体含量（VS）的具体测定步骤如下：

①将待用的瓷坩埚洗净后放在马弗炉中灼烧1 h（600℃），待炉温降到100℃取出，置于干燥皿中冷却至室温并称重，记为m1，单位g，精确到mg。

②将待测料液加入到已称重的坩埚中，约二分之一处。然后放入电子天平内称重，记为m2，单位g，精确到mg。

③将第二步中称完重量获得的含有样品的坩埚放入鼓风干燥箱内，在105℃下干燥至恒重，约为5 h。取出，置于干燥皿中冷却至室温并称重，记为m3，单位g，精确到mg。

④将第三步干燥后的坩埚再置于马弗炉中，在550～600℃下灼烧2 h后，待炉温降至100℃以下取出，置于干燥皿中冷却至室温后称重，记为m4，单位g，精确到mg。

⑤计算公式为（1）和（2）：

式中，m1-坩埚重量（g）；m2-样品加坩埚的重量（g）；m3-105℃干燥后样品加坩埚的重量（g）；m4-550℃干燥后样品加坩埚的重量（g）。

pH采用实验室用数显酸度计PHS-3C测定。氨态氮（NH4+）采用Foss Kjeltec 2300全自动凯式定氮分析仪根据仪器标准分析方法测定。

采用1 L铝箔集气袋（大连海得）收集气体，体积测定采用排水法。气体组成成分及含量分析采用GC-6890N（安捷伦，美国）气相色谱测定，装载TDX-01型填充柱和热导检测器（TCD）。色谱条件如下：氩气作为载气，其流量设置为40 mL·min-1；进样口温度120℃，柱箱温度170℃，检测器温度220℃。

试验中所得的累计产氢量和挥发性固体产氢量计算公式为（3）和（4）：

式中，VH,i-CH,i试验在i时刻的混合气体中氢气的体积分数（%）；Vi-试验i时刻的混合气体的体积（mL）；V0-集气袋的体积（mL）；VH,i-试验在i时刻得到的累计产氢量（mL）；VH-试验累计的产氢量（mL）；VS0-发酵底物的挥发性固体含量（g）；V'H-试验所得挥发性固体产氢量（mL·g-1）。

发酵液中的挥发性脂肪酸（VFAs，包括乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸）以及乙醇含量用GC-6890N（安捷伦，美国）气相色谱测定。此时色谱仪采用毛细管柱（Agilent 1909/N-133 HP-INNOWAX Polyethylene Glycol）和氢火焰离子化检测器（FID）。色谱条件如下：氮气作为载气和尾吹气，载气采用187 kPa恒压模式，尾吹气流量为30 mL·min-1；进样口温度为220℃，初始炉温为60℃，开始运行后以15℃·min-1的速度升至140℃并维持2 min，检测器温度为250℃。整个测定时间为7.33 min。

乳酸采用高效液相色谱测定（WATERS 600E-2487），采用紫外检测器（210 nm）和250 mm×4.6 mm C18色谱柱，以乙腈和磷酸（体积比为2.5∶97.5）为流动相。

用于测定VFA的发酵液样品先在5 000 r·min-1下离心10 min，取上清液用25%HPO3以酸液比为1∶10进行酸化，然后再于15 000 r·min-1下离心10 min，取上清过0.45 μm滤膜后，直接进样。

2 结果与分析

2.1 底物浓度对产氢性能的影响

底物浓度对VS产氢量的影响规律如图1所示，VS产氢率是累积产氢量同发酵开始时所添加挥发性固体质量的比值，反映微生物利用原料产氢的效率。当底物浓度变化范围为20～200 g·L-1时，其挥发性固体产气率分别为18.51、27.01、31、31.05、26.85、19、14.05、7.53、2.65和0.9 mL·g-1。当底物浓度从20 g·L-1增加至60 g·L-1时，VS产氢量呈现明显的增长趋势。底物浓度为60～80 g·L-1范围内，VS产氢率无变化，维持在30 mL·g-1。底物浓度增至100 g·L-1以后，VS产氢率呈现下降趋势。当底物浓度达到120 g·L-1时，VS产氢率明显降低，预示此时底物浓度可能已达到系统稳定运行上限。在底物浓度大于120 g·L-1以后，由图1可知，底物浓度完全抑制厌氧产氢发酵。

底物浓度对累计产氢量的影响如图2所示，过低或过高底物浓度的厌氧发酵产氢体系累计产氢量很低。当底物浓度变化范围为20～200 g·L-1时，其累计产气量分别为101、294、506、672、733、620、535、327、129和48 mL，当底物浓度从20 g·L-1增加至100 g·L-1时，累计产氢量呈增长趋势。且当底物浓度达到100 g·L-1时，累计产氢量达到最大729 mL。当底物浓度继续升高时，累计产氢量却急剧下降，到底物浓度为200 g·L时，几乎无氢气产生。因此当底物浓度为100 g·L时，体系产氢效率最高。

图1 底物浓度对挥发性固体产氢率的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on VS hydrogen production rate

图2 底物浓度对累计产氢量的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on accumulative hydrogen yield

由图2可知，当葡萄糖浓度为5 g·L时，得到最大累积产氢量为3 500 mL·L-1，而万伟等在葡萄糖浓度为25 g·L-1时获得的最大累积产氢量为4 268 mL·L-1[14]，这一结果与汤桂兰等[15]试验结果一致。可见对于混菌发酵产氢即使都采用单纯原料，根据试验条件不同，产氢性能存在较大差异。虽然本研究得到的累积产氢量略低于汤桂兰[15]结果，但由于本研究采用的原料是餐厨废弃物和牛粪按照相等TS比例混合物，其中牛粪几乎不含糖，餐厨废弃物含糖量约为TS 25%，按照此比例计算底物浓度80 g·L-1相当于10 g·L-1葡萄糖，因此产氢能力与万伟[14]结果相近。

2.2 底物浓度对液相产物和pH的影响

在产酸产氢厌氧发酵过程中，液相末端产物（乙醇和挥发性脂肪酸）可为产甲烷相中的产甲烷菌提供新陈代谢的影响物质，其组分不同对产甲烷发酵的效率有很大影响。因此，对产氢相流出液的组成成分进行考查能够反映整个发酵系统的能源化潜力，是厌氧发酵过程中重要指标[16]。本研究中产氢发酵的液相代谢产物主要为氨氮、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和乳酸。底物浓度对液相代谢产物产量及分布的影响见表3。由表3可见，随着底物浓度从20 g·L-1提升10倍至200 g·L-1时，液相代谢产物有机酸总浓度明显升高。在本试验的底物浓度范围内，发酵体系的各种代谢产物的分布比较均衡。

随着底物浓度的提高，氨浓度由25.95 mmol·L-1提升至89.78 mmol·L-1，由于随着底物浓度增加，蛋白质、尿素、尿酸等含氮物质也相应增加，所以氨浓度明显上升。但氨在液相代谢产物中所占比例却逐渐下降。原因为一是糖类和蛋白类底物的竞争作用，氨化过程是氨化菌分解蛋白质等含氮有机物作为能源的过程，当底物浓度提高时糖类物质浓度显著提高，使氨化菌对蛋白质分解代谢能力减弱。二是代谢产物抑制作用，在氨态氮浓度较高时，游离态氨浓度显著提高。研究表明游离态氨可通过扩散作用进入到细胞内部，抑制细胞活性。

随着底物浓度提高，总有机酸浓度自然呈逐渐升高趋势。但各种酸成分比例却呈不同变化趋势，底物浓度在20～80 g·L-1时，总有机酸中丁酸、乙酸含量逐渐上升，同时VS产氢率也逐渐升高，此时发酵体系发生如方程（5）、（6）所示的代谢反应。

当底物浓度高于100 g·L-1并逐渐上升时，液相末端产物中丁酸、乙酸所占含量较少，VS产氢率也很少，但乳酸含量却逐渐升高，此时厌氧发酵体系的代谢正向方程（7）进行转变。

在整个发酵过程中，所有处理组pH变化不明显，在底物浓度小于80 g·L-1时，pH维持在5.70～6.01之间，虽然厌氧发酵体系pH随底物浓度的升高呈降低趋势，但在比较适宜的产氢范围内（pH＞5.0）[17]。可见添加牛粪可有效缓解餐厨废弃物厌氧发酵产氢过程中易酸化致使pH下降导致产氢过程停止问题。

2.3 底物浓度对底物降解的影响

底物的挥发性固体去除率如图3所示，呈现先升后降的趋势，当底物浓度低于80 g·L-1时，VS降解率随底物浓度提高略有上升；在适当的底物浓度范围内，随着底物浓度的升高，微生物活性增强，从而提高挥发性物质的去除率。在底物浓度为80 g·L-1时，VS降解率达到最大值29.34%；但当底物浓度超过80 g·L-1后，VS降解率随底物浓度增加快速下降，最终当底物浓度为200 g·L-1时，VS降解率仅为14%；底物浓度过高，会增大传质阻力不利于微生物与原料接触，影响厌氧微生物活性。所以，适宜的底物浓度有助于细菌活动。上述结果表明牛粪和餐厨废弃物混合浓度适当可显著提高底物降解率。

图3 不同底物浓度下挥发性固体去除率Fig.3 VS degradation rate at different substrate concentration

对葡萄糖浓度影响产氢生物产氢的研究结果表明[17]，当底物浓度低于25 g·L-1时浓度的增加对底物降解率影响不大。但在本研究中底物浓度在20～80 g·L-1范围内时，VS降解率却随底物浓度增加而提高，这可能是因为万伟等[14]所使用的原料是以葡萄糖为主的营养液，易于被发酵微生物降解，而本研究中的原料是牛粪和餐厨废弃物的混合物，不但成分复杂而且难于降解，需要较多的营养物质才能使发酵体系中的微生物数量达到一定水平，发挥出混合微生物群落的协同作用。在批式发酵时，微生物生长一般要经历延迟期、加速期、指数生长期、减速期、静止期和死亡期等阶段。而当底物浓度较低时，营养物质很快被耗尽，微生物只经历短暂的指数生长期即停止增殖，无法形成数量优势，导致VS降解率较低。当底物浓度逐渐提高时，发酵微生物得到充足养分，可经历较长的对数生长期，发酵体系能获得较高微生物密度，代谢活性也较高，可产生大量酶，获得较高的VS降解率。但是当底物浓度进一步提高时，一方面发酵过程的传质效率降低，使微生物无法与底物充分接触；另一方面，发酵体系离子活度降低，渗透压升高，抑制微生物生长；伴随氢气产生的有机酸会对底物的降解起反馈抑制作用，降低酶活性，达到一定限度后会导致发酵微生物死亡和VS降解率降低。

3 讨论

3.1 底物浓度对产氢性能的影响

本试验共设置10种不同的浓度水平，其取值范围为20～200 g·L-1，覆盖在厌氧发酵实际生产中常用的所有浓度范围。在厌氧发酵过程中，底物浓度过高容易增加发酵体系的传质阻力，不利于营养物质与微生物的充分接触；相反，底物浓度过低会增加原料稀释用水量和加热体系的耗能量，还会增加污水排放量，给实际生产造成难题。所以，选择适合的底物浓度，无论是对发酵条件优化还是对实际生产需要都至关重要。在本试验中，底物浓度不同产气率有较大差异，结果表明，底物浓度过低或过高都不利于厌氧发酵系统产氢。当底物浓度在40～100 g·L-1变化时，底物的产氢率相差不大，具体为当底物浓度分别为40、60、80和100 g·L-1时累计产氢量分别为294、506、672和729 mL，VS产氢量分别为27.01、31、31.05和26.85 mL·g-1。当底物浓度为40 g·L-1累计产氢量很低，不宜用于实际生产中。当底物浓度从60到100 g·L-1变化时累计产氢量逐渐增大，VS产氢率却呈下降趋势。因为在实际生产中，常常要综合考虑累计产氢量和VS产氢率来确定生产工艺，当底物浓度为80和100 g·L-1时，累计产氢量和VS产氢量均较高，因此，在实际生产中，为了有效降低产氢发酵成本应进一步考查该两组试验水平组合。

3.2 底物浓度对液相产物和pH的影响

在实际生产中，为实现有机底物利用率的最大化，常将产氢发酵体系的流出液用作产甲烷相的底物继续发酵，而产甲烷菌几乎不能消化乳酸，主要利用乙酸、丁酸等的裂解进行产甲烷代谢。因此，探讨产氢相液相产物组成对实际生产具有重要意义。如表3所示，当底物浓度低于100g·L-1时，液相代谢产物中乙酸+丁酸的含量均占总有机酸的50%以上。在较高的底物浓度下，产氢发酵体系产生乳酸的量更多，而丁酸、乙酸的量相对较少。因此，在底物浓度低于100 g·L-1时，产氢相流出液更适合作为后续产甲烷发酵的底物。

3.3 底物浓度对底物降解率的影响

本试验中，较低底物浓度下，厌氧发酵产氢过程均可获得较高底物降解效率。在营养物质不足或较少的情况下，微生物可在有效时间内对其分解利用。反观底物浓度较高的处理组，即100 g·L-1以上底物降解率明显降低，说明底物浓度过高时、微生物不能对其充分利用，原料利用率下降。因此，本试验选择底物浓度范围不超过80 g·L-1为宜。

4 结论

底物浓度显著影响餐厨废弃物与牛粪混合厌氧发酵产氢率。当底物浓度为80 g·L-1时VS产氢率最高为31.05 mL·g-1，当底物浓度为100 g·L-1时累积产氢量最高为729 mL。随着底物浓度升高，发酵体系微生物代谢途径发生变化，液相中有机酸组分比例开始由乙酸、丁酸逐渐向乳酸转化。当底物浓度低于100 g·L-1时，液相代谢产物中乙酸+丁酸的含量均占总有机酸50%以上，有利于将产氢相流出液继续用于产甲烷发酵。因此，综合体系产氢效率和液相中有机酸组分比例两方面因素，在实际生产中应将底物浓度设置为80或100 g·L-1为宜，该浓度下可实现有机底物最大化开发利用。

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Effect of substrate concentration on the anaerobic hydrogen fermentation with a mixture of food waste and cattle manure

LI Wenzhe,YIN Lili, WANG Ming,LIU Shuang,LIU Dan,LI Jingyu(School of Engineering,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to improve the ability of anaerobic hydrogen co-digestion,a batch experiments with food waste and cattle manure mixed according to the 1∶1(basis∶dry matter)as the substrance of anaerobic digestion was conducted under(35±1)℃for hydrogen production.The effect of substrance concentration on the specific hydrogen production rate,pH,and liquid products was investigated.As a result,the maximums of hydrogen yield,the volumetric hydrogen yield and the VS degradation rate (31.05 mL·g-1,672 mL·L-1and 29.34%,respectively)were obtained at the substrates concentration of 80 g·L-1.The pH was maintained in the range of 5.48-5.81,acetic and butyric acids which can be as the substance of methane fermentation were the main liquid products.

hydrogen;cattle manure;food waste;anaerobic fermentation

X71；TQ920.6

A

1005-9369（2014）05-0103-07

2013-12-03

“十二五”国家支撑计划项目（2011BAD15B04）

李文哲（1955-），男，教授，博士生导师，研究方向为生物质转化与利用。E-mail:liwenzhe9@163.com

时间2014-5-12 9:02:12[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140512.0902.024.html

李文哲,殷丽丽,王明,等.底物浓度对餐厨废弃物与牛粪混合产氢发酵的影响[J].东北农业大学学报,2014,45(5):103-109.

Li Wenzhe,Yin Lili,Wang Ming,et al.Effect of substrate concentration on the anaerobic hydrogen fermentation with a mixture of food waste and cattle manure[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):103-109.(in Chinese with English abstract)