大豆主要品质性状资源评价及分子标记分析

赵雪，韩英鹏，李海燕，滕卫丽，李文滨

（东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，东北农业大学农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030）

大豆主要品质性状资源评价及分子标记分析

赵雪，韩英鹏，李海燕，滕卫丽，李文滨*

（东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，东北农业大学农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030）

对黑龙江省92个大豆品种（系）的蛋白质和油分含量进行评价，应用SSR标记分析和发掘与蛋白质及油分含量性状相关联的分子标记。结果表明，黑龙江大豆种质蛋白质和油分含量变异丰富，年际间数据较为稳定；53个SSR标记在92个品种中检测到121个等位变异，品种间相似度范围12%～77%；利用亲缘关系树和蛋白质及油分含量表型分析发现蛋白质含量分界值为44%，油分含量分界值为20%；Satt561-250与蛋白质含量呈显著相关，Satt428-242与油分含量呈显著相关，该分子标记为蛋白质和油分性状的资源筛选和辅助育种提供依据。

大豆；蛋白质含量；油分含量；SSR标记

大豆蛋白是人类食用和饲用植物蛋白的主要来源，大豆油消费又占世界植物油消费首位[1]。近年来，高蛋白和高油分的特用大豆品种选育和利用成为大豆育种者和生产者关注重点[2]。分子标记辅助育种技术是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择，以期在早期世代即能对目标基因的转移进行准确、稳定选择，克服隐性基因再度利用时识别困难，在提高育种效率，选育抗病、优质、高产的品种等方面发挥重要作用[3]。大豆蛋白质和油分含量属复杂数量性状，受环境影响大[4]，筛选蛋白质及油分含量表现稳定的大豆基因型和连锁的分子标记应用于遗传改良，可提高优良资源利用效率，加速优良品种选育的进程。黑龙江省是中国大豆的主要产区，通过对黑龙江栽培大豆种质资源蛋白质和油分品质进行评价，探索黑龙江栽培大豆种质资源主要品质性状的多样性，对于优化品质结构，提高黑龙江主栽大豆品种在大豆总产中的比例具有重要作用。

本研究以黑龙江代表性大豆种质资源为研究对象，旨在评价供试材料的遗传多样性及蛋白质和油分性状的表型变异多样性，筛选优异大豆种质资源，分析目标性状与分子标记之间的关系，为优质大豆品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2011、2012年在东北农业大学香坊实验实习基地种植，92个黑龙江省主栽大豆品种，按小区种植，随机排列，3次重复，6行区，行长6 m，行距0.70 m，株距0.05 m，管理同生产田。品种材料的名称和来源见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆种子蛋白质含量测定

选择粒圆、饱满、无虫食的大豆籽粒，采用近红外谷物分析仪（Foss1241，瑞典）进行蛋白质和油分含量测定。

1.2.2 大豆基因组DNA提取及分子标记分析

采集供试品种健康叶片保存于超低温冰箱中备用，基因组DNA提取采用CTAB法[5]，方法略有改动。选取10份大豆种质DNA对600个SSR标记进行多态性筛选，选择PCR产物单一且在品种间多态性良好的SSR标记引物进行全部供试种质资源的基因分型。SSR标记引物根据SoyBase网址（http://www.soybase.org）提供的序列，由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系总体积16 μL，包括2.4 μL DNA，1.6 μL PCR buffer，1.2 μL MgCl2（25 mmol·L-1），0.24 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），0.24 μLTagDNA聚合酶（5 U·μL-1），4 μL正反向混合引物（4 μmol·L-1）以及6.32 μL去离子水。PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。

1.3 数据分析

用数字1和0分别表示供试材料某一等位位点的有无，有记为“1”，无记为“0”，建立0和1数据库。SSR位点的等位变异数和多态性信息含量（Polymorphism information content，PIC）按如下公式计算：PIC=1-∑Pi2，式中，Pi是群体中含有第i个等位位点的比例[6]。用NTsys 2.10e软件进行遗传相似系数估计，利用非加权类平均法UPGMA（Unweight pairgroup method using arithmetic averages）对所有供试种质建立树状图。对0，1矩阵进行聚类分析，建立树状图[7]，采用Li等报道的统计方法进行基因型与分子标记的关联性分析和差异评价[8]。

2 结果与分析

2.1 大豆蛋白质和油分含量的统计与分析

2011年和2012年供试材料种子蛋白质和油分含量分布如图1所示，黑龙江主栽大豆品种蛋白质含量总体以43%～45%居多，分布于这个区间的样本数两年均值占总数55.4%，蛋白质含量在42%以下和在46%以上的为少数，分别占总数的11.9%、4.34%。油分含量总体以19%～21%居多，占总数的70.6%，油分含量在19%以下和在22%以上的为少数，分别占总数的14.1%、3.26%。

黑龙江主栽大豆品种蛋白质含量变化范围为40.78～47.03，变异系数为0.03，最大值为47.06，最小值为40.74。由表2可知：黑龙江主栽大豆品种油分含量变化范围为17.10～28.14，变异系数为0.066，最大值为28.14，最小值为17.10。通过表型分析说明黑龙江大豆种质蛋白质和油分含量在表型上存在丰富的变异，且同一地点的年际间数据较为稳定。

表1 材料名称及来源Table 1 Variety name and origin

图1 2011年和2012年供试品种蛋白质和油分含量的分布Fig.1 Distribution of oil and protein content of tested soybean varieties in 2011 and 2012

表2 大豆蛋白和油分含量的统计分析Table 2 Analysis of protein and oil content in soybean varieties

2.2 蛋白质和油分含量与SSR标记基因型的相关分析

所筛选的600个SSR标记中的53个在测试材料中表现为多态性，PCR产物单一且条带清晰。进一步分析发现53个SSR位点共检测到121个等位变异，平均等位变异数为每个位点2.28个，多态性信息含量（PIC）的变化范围为0.112～0.795。所有位点中大部分等位变异数为2个，Satt518、Satt314和Satt114等15个标记位点检测3个以上的等位变异。53个位点等位基因数和多态性信息含量见表3。

依据SSR标记基因型矩阵构建92份供试材料的亲缘关系树图（见图2）。供试材料相似性系数范围为12%～77%，表明材料之间的亲缘关系较为接近。亲缘关系与蛋白质及油分表型联合分析发现（如图2虚线指示），蛋白质含量大于44%和小于44%的大豆品种（系）分别表现为成簇分布；同时油分含量在20%这一临界值处在亲缘关系树上大致被分为两大类。

表3 SSR标记位点等位变异数及多态性信息含量Table 3 Number of allelic variations and PIC value of SSR markers

续表

图2 大豆种质资源油分（左）和蛋白质（右）的表型多样性聚类分析Fig.2 Cluster analysis of oil（left）and protein（right）content for tested accessions

进一步利用t测验对分子标记基因型与目标性状表型值进行方差分析，共获得2个分子标记与目标性状关联（见表4）。

其中位于Gm01染色体的SSR标记Satt561，其长度为250 bp等位变异与蛋白质含量低值表型组显著关联，方差为-0.30。位于Gm19染色体的SSR标记Satt428，其长度为242 bp的等位变异与油分含量的关联达到显著水平。

表4 与大豆蛋白和油分含量相关的SSR分子标记Table 4 SSR markers associated with protein or oil content of soybean

3 讨论

种质资源的多样性反映在表现型和基因型两个方面，表现型受环境影响，其影响程度依研究性状不同而不同，大豆蛋白质和油分性状是大豆重要的品质性状，属于复杂数量性状范畴，针对此类性状进行资源评价要依靠多年多点的试验数据，DNA分子标记技术在育种中广泛应用，克服针对表型选择的缺陷，实现对基因型的直接选择。本研究利用SSR标记和蛋白质及油分含量的联合分析，将两个性状高表型值和低表型值明确分类，为两个性状的种质资源分类利用提供参考。

利用DNA分子标记技术评价种质资源已有报道，宋喜娥等报道中国栽培大豆微核心种质遗传多样性平均PIC为0.743[9]，Narvel等用74个SSR引物分析39份大豆优良品种PIC（0.50）和40份引进种质PIC（0.56）[10]，谢华等用4个引物仅在中国秋大豆核心种质中检测出等位变异数目与前者相当[11]，但PIC（0.83）高于前者。栾维江等从3 226份东北春大豆中选择283份种质进行表型性状和SSR检测结果表明，吉林省和辽宁省种质遗传多样性表现较为一致，均高于黑龙江省种质遗传多样性[12]。本研究结果得到的等位变异和引物平均PIC都小于国内外研究者报道[9-12]，同类研究发现[9-12]，不同研究所针对的材料各有其特征，差异源于种质资源区域代表性，群体大小，分子标记类型以及标记数目等，故同类研究类比存在一定偏差，针对各产区大豆种质资源建立区域代表性核心种质库以及育成品种明确的系谱关系对整合个性化研究结果和种质资源的有效利用尤为重要。

本研究通过分子标记与表型关联性分析各获得一个与蛋白质和油分含量相关联的等位变异，其中控制蛋白质含量的Satt561被报道与粒重性状连锁[13]，Hyten等发现该标记与控制大豆生殖生长的性状有关[14]；而控制油分含量的Satt428被报道与豆荚重量关联[15]，蛋白质和油分是大豆籽粒的主要成分，且在生殖生长阶段于籽粒中积累，因此可以推断本研究与已知位点存在一定重叠。所检测到等位变异对辅助选择籽粒蛋白油分含量贡献需进一步验证。

4 结论

本研究利用SSR标记评价黑龙江大豆种质资源的遗传多样性，发现供试材料亲缘关系较近，遗传基础相对狭窄，但从种子蛋白质和油分含量性状的表型分布来看，仍存在较广泛的遗传变异，因此在今后的研究工作中，对现有资源的高效利用和新变异引进非常重要。Satt561-250与蛋白质含量大于44%的黑龙江主栽大豆品种呈显著相关，Satt428-242与油分含量大于20%的黑龙江主栽大豆品种呈显著相关，上述等位变异可用于指导高蛋白和高油分含量大豆品种的分子辅助选择育种。

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Evaluation and molecular marker analysis of soybean germplasm in main quality traits

ZHAO Xue,HAN Yingpeng,LI Haiyan,TENG Weili,LI Wenbin(Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education(Key Laboratory of Soybean Biology and Breeding/Genetics of Chinese Agriculture Ministry),Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

In this study,a total of 92 soybean cultivars or lines from Heilongjiang Province were used to evaluate the seed protein and oil contents in 2011 and 2012.SSR molecular markers were used to analyze genetic relationship of the tested soybean accessions and detect allelic variation associated with the two target traits.The results showed that the protein and oil contents of tested accessions were relative stable in different years.A total of 121 allelic variations were identified in 53 SSR markers.The similarity of accessions was ranged from 12%to 77%indicating that the relationship between these accessions was near.The total samples were divided into two groups by the critical value(44%)for protein content and(20%)for oil content.The allele that Satt564-250 was found to associate with protein content and Satt428-242 was found to associate with oil content.These markers will be useful for germplasm identification of high protein and oil content and for molecular assisted breeding for soybean quality traits.

soybean;protein content;oil content;SSR marker

S326；S565.1

A

1005-9369（2014）05-0001-07

2013-03-11

国家“十二五”科技支撑计划（2011BAD35B06-1）；现代农业农业部大豆产业技术体系项目（CARS-04-PS04）；国家重点基础研究发展计划“973计划”前期项目（2012CB126311）；国家自然基金项目（31201227，31301339）；中国博士后项目（20110491024）；黑龙江省博士后项目（LBH11220，LBH-TZ1210）；黑龙江省教育厅骨干教师项目的资助项目（1252G014）；黑龙江省教育厅新世纪项目优秀人才资助项目（1253-NCET-005）；教育部博士点项目（20122325120012）；东北农业大学博士后启动金项目资助（2012RCB11）

赵雪（1983-），女，助理研究员，博士，研究方向为大豆遗传育种。E-mail:zhaoxue_s@163.com

*通讯作者：李文滨，教授，博士生导师，研究方向为大豆遗传育种。E-mail:wenbinli@neau.edu.cn

时间2014-5-12 8:58:59[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140512.0859.004.html

赵雪,韩英鹏,李海燕,等.大豆主要品质性状资源评价及分子标记分析[J].东北农业大学学报,2014,45(5):1-7.

Zhao Xue,Han Yingpeng,Li Haiyan,et al.Evaluation and molecular marker analysis of soybean germplasm in main quality traits[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):1-7.(in Chinese with English abstract)