海洋真菌Penicillium sclerotiorum FS50 的化学成分研究

陶美华，李乐军，陈玉婵，霍光华，章卫民*

1省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室广东省微生物研究所，广州 510070;2 江西农业大学生物科学与工程学院，南昌 330045

海洋微生物长期生活在海洋环境中，具有应对高盐、弱碱性、低营养、缺氧等恶劣环境的能力，在其生长过程中能够产生有别于陆生微生物的次级代谢产物，其中海洋真菌因其生长速度快、易于培养、可通过大规模发酵实现工业化生产等优势受到人们的广泛关注。海洋真菌的次生代谢产物结构类型多样，主要包括聚酮类、萜类、甾体、生物碱、肽类及其它含氮化合物等［1］，其中不乏活性显著、结构新颖的化合物［2］。海洋真菌已成为继海洋放线菌之后的又一研究热点。

为了从海洋真菌中寻找结构新颖的活性代谢产物，本课题组对分离自南海沉积物的海洋真菌进行了抗肿瘤、抗菌活性筛选，发现菌核青霉Penicillium sclerotiorumFS50 对肿瘤细胞MCF-7 的抑制率为97.6%，对金黄色葡萄球菌的抑制率为72.8%［3］。本研究在此基础上对菌株FS50 的次级代谢产物进行深入研究，从该菌株的液体发酵产物中共分离得到9 个化合物，分别鉴定为penicilazaphilone B(1)、sclerotioramine(2)、紫檀醇(3)、亚油酸甘油酯(4)、(3β，5α，6β，22E)-6-methoxyergosta-7，22-diene-3，5-diol(5)、啤酒甾醇(6)、对羟基苯乙酮(7)、酪醇(8)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(9)(图1)。其中化合物3 为首次从青霉属中分离得到，化合物2、4、5、6、8、9 为首次从菌核青霉中分离得到。化合物3同时存在于发酵液及菌丝体中，化合物1、7 为从发酵液中获得，化合物2、4、5、6、8、9 为从菌丝体中获得。

1 仪器与试剂

AVANCE III 型500 MHz 核磁共振波谱仪，Bruker 公司;PZ1000B 旋转式大容量普通摇床，武汉瑞华仪器设备有限公司;RE-2000 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;超净工作台，上海恒益科技有限公司;LC-20AT 型高效液相色谱仪，日本岛津公司;柱层析硅胶(100～200 目、200～300 目)，青岛海洋化工厂;高效薄层硅胶板Silica gel 60 F254，Merck 公司;C18反相硅胶(40～75 μm)，Fuji Silysia Chemical Ltd.;凝胶Sephadex LH-20(18～110 μm)，Amersham Biosciences;溶剂及试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

2 菌种与发酵培养

菌株FS50 于2009年12月分离自南海(21°30.736'N，116°54.842'E)336 米深处的沉积物，经鉴定为菌核青霉(Penicilliumsclerotiorum)［3］。发酵培养基为马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基:马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，海盐15 g/L，维生素B110 mg/L，pH 自然。用接种针挑取适量活化好的菌体接种到装有250 mL PD 液体培养基的500 mL 锥形瓶中，在28 ℃、130 rpm 条件下摇床培养3 d，获得种子液。将种子液按照5%的接种量接种到装有250 mL PD 液体培养基的500 mL 锥形瓶中，培养条件与种子液相同，培养时间为7 d，共发酵100 L。

图1 化合物1～9 的结构式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-9

3 提取与分离

发酵产物经过滤得发酵液和菌丝体，发酵液用乙酸乙酯按1∶1 比例萃取4 次，40 ℃下减压浓缩得浸膏28 g;菌丝体置于50 ℃烘箱中烘干后粉碎，甲醇浸泡并用超声波破碎细胞壁，共浸提4 次，收集甲醇提取液浓缩至无醇味，加适量水悬浮，再用乙酸乙酯萃取5 次，40 ℃减压浓缩得浸膏98 g。发酵液提取物浸膏过正相硅胶柱，以石油醚/乙酸乙酯(50∶1→1∶2)及氯仿/甲醇(15∶1→1∶1)梯度洗脱，得到组分F-A～F-C。石油醚/乙酸乙酯(5∶1)洗脱得到的F-B 组分经凝胶柱二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脱得到组分F-B-1，再经半制备HPLC 甲醇/水(50∶50→70∶30)梯度洗脱，分别得到化合物7(15.5 mg)和3(2.3 mg)。氯仿/甲醇(10∶1)洗脱下来的组分F-C 用甲醇/水(70∶30)洗脱得到化合物1(17.3 mg)。菌丝体提取物浸膏过正相硅胶柱得到6 个组分J-A～JF。石油醚/乙酸乙酯(8∶1)洗脱得到组分J-A 经凝胶柱二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脱得到化合物3(30.0 mg)。石油醚/乙酸乙酯(3∶1)洗脱得到组分J-B 以甲醇/水(50∶50)为洗脱剂经C18反相柱洗脱得到组分J-B-3，再以二氯甲烷/甲醇(1∶1)为洗脱剂的凝胶柱纯化得到油状无色化合物4(11.3 mg)。石油醚/乙酸乙酯(3∶1)洗脱得到的组分J-C 以二氯甲烷/甲醇(1∶1)为洗脱剂经凝胶柱得到组分J-C-1，组分J-C-1 再经石油醚/乙酸乙酯(3∶1→1∶1)正相柱梯度洗脱得到组分J-C-1-1 和白色粉末状化合物8(43.3 mg)，组分J-C-1-1 再经甲醇/水溶液(80∶20)过C18反相柱得到油状化合物9(35.4 mg)。石油醚/乙酸乙酯(1∶1)洗脱下来的组分J-D 以半制备HPLC 甲醇/水溶液(50∶50)洗脱得到无色晶状化合物5(15.6 mg)。氯仿/甲醇(15∶1)洗脱得到的组分J-E 和J-F 分别经凝胶柱二氯甲烷/甲醇(1∶1)纯化得到白色粉末状化合物6(10.0 mg)和红色粉末状化合物2(34.3 mg)。

4 结构鉴定

化合物1 黄色粉末状物质ESI-MSm/z:353［M+H］+，351［M-H］-，分子式为C19H28O6;1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:4.77 (1H，dd，J=10.7，5.4 Hz，Ha-1)，3.78 (1H，dd，J=13.5，10.7 Hz，Hb-1)，5.75 (1H，s，H-4)，5.69 (1H，d，J=2.1 Hz，H-5)，3.06 (1H，m，Ha-8)，3.39 (1H，d，J=9.6 Hz，Hb-8)，6.19 (1H，d，J=15.6 Hz，H-9)，6.67 (1H，d，J=15.6 Hz，H-10)，3.41 (1H，d，J=2.2 Hz，H-12)，1.71 (1H，m，H-13)，1.43 (1H，m，Ha-14)，1.29 (1H，m，Hb-14)，0.91 (3H，t，J=7.4 Hz，H-15)，0.87 (3H，d，J=6.8 Hz，H-16)，1.32 (3H，s，H-17)，1.38 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:69.6 (C-1)，161.8 (C-3)，104.5 (C-4)，154.1 (C-4a)，116.4 (C-5)，198.9 (C-6)，75.2 (C-7)，75.4 (C-8)，36.8 (C-8a)，122.1 (C-9)，143.1(C-10)，76.2 (C-11)，80.4 (C-12)，35.8 (C-13)，29.5 (C-14)，11.7 (C-15)，13.8 (C-16)，25.8 (C-17)，19.0 (C-18)。以上数据与文献报道基本一致［4］，故鉴定化合物1 为penicilazaphilone B。

化合物2 红色粉末状物质EI-MSm/z:389［M］+，分子式为C21H24ClNO4;1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:8.16 (1H，s，H-1)，7.17 (1H，s，H-4)，6.86 (1H，d，J=15.5 Hz，H-9)，7.03 (1H，d，J=15.5 Hz，H-10)，5.73 (1H，d，J=9.7 Hz，H-12)，2.53 (1H，m，H-13)，1.46 (1H，m，Ha-14)，1.34(1H，m，Hb-14)，0.90 (3H，t，J=7.4 Hz，H-15)，1.03 (3H，d，J=6.6 Hz，H-16)，1.92 (3H，s，H-17)，1.52 (3H，s，H-18)，2.14 (3H，s，H-20);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:145.1 (C-1)，152.9 (C-3)，111.5 (C-4)，148.0 (C-4a)，100.7 (C-5)，184.8 (C-6)，85.8 (C-7)，194.9 (C-8)，115.7 (C-8a)，118.3 (C-9)，145.7 (C-10)，133.8 (C-11)，147.7 (C-12)，35.7 (C-13)，30.7 (C-14)，11.9 (C-15)，19.8 (C-16)，12.4 (C-17)，23.4 (C-18)，171.3 (C-19)，20.2 (C-20)。以上数据与文献报道基本一致［5］，故鉴定化合物2 为sclerotioramine。

化合物3 白色粉末状物质ESI-MSm/z:238［M］+，261 ［M+Na］+，分子式为C15H26O2。1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:3.78 (1H，m，H-2)，1.96(1H，t，J=11.7 Hz，H-5)，1.17 (3H，s，H-12)，1.17(3H，s，H-13)，0.71 (3H，s，H-14)，4.82 (1H，d，J=1.5 Hz，Ha-15)，4.57 (1H，d，J=1.5 Hz，Hb-15);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:51.2 (C-1)，68.0(C-2)，46.7 (C-3)，149.2 (C-4)，50.0 (C-5)，41.5(C-6)，49.9 (C-7)，25.3 (C-8)，22.6 (C-9)，35.5(C-10)，72.8 (C-11)，26.8 (C-12)，26.3 (C-13)，17.0 (C-14)，107.6 (C-15)。以上数据与文献报道的基本一致［6］，故鉴定化合物3 为紫檀醇。

化合物4 无色油状物质1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:4.21 (1H，dd，J=4.6，11.6 Hz，Ha-1)，4.16 (1H，dd，J=6.2，11.6 Hz，Hb-1)，3.94 (1H，m，H-2)，3.70 (1H，m，Ha-3)，3.61 (1H，m，Hb-3)，2.36 (2H，t，J=7.6 Hz，H-2')，1.63 (2H，m，H-3')，5.36 (4H，m，H-9'，H-10'，H-12'，H-13')，2.78(2H，t，J=6.5 Hz，H-11')，2.06 (4H，m，H-8'，H-14')，0.90 (3H，t，J=6.9 Hz，H-18');13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:66.0，64.2 (C-1，C-3)，71.1 (C-2)，35.0，32.4，30.4，30.2，30.0，29.9，28.1，28.0，26.5，25.8，23.4 (C-2'，C-3'，C-4'，C-5'，C-6'，C-7'，C-8'，C-11'，C-14'，C-15'，C-16'，C-17')，131.1，130.9，128.9，128.8 (C-9'，C-10'，C-12'，C-13')，14.9 (C-18')，175.2 (C=O)。以上数据与文献报道的基本一致［7］，故鉴定化合物4 为亚油酸甘油酯。

化合物5 白色粉末状物质EI-MSm/z:444［M］+，分子式为C29H48O3;1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:1.56 (4H，br m，H-1，H-11)，1.87 (4H，br m，Ha-2，H-9，H-14，H-24)，1.47 (4H，br m，Hb-2，H-15，H-25)，4.06 (1H，m，H-3)，2.14 (1H，m，Ha-4)，1.76 (2H，br m，Hb-4，Ha-16)，3.18 (1H，d，J=5.0 Hz，H-6)，5.41 (1H，m，H-7)，2.04 (2H，br m，Ha-12，H-20)，1.30 (3H，m，Hb-12，Hb-16，H-17)，0.61(3H，s，H-18)，1.01 (3H，s，H-19)，1.03 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，5.17 (1H，dd，J=15.3，7.7 Hz，H-22)，5.20 (1H，dd，J=15.3，7.7 Hz，H-23)，0.84(6H，d，J=6.4 Hz，H-26，H-27)，0.93 (3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，3.40 (3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:33.6 (C-1)，31.8 (C-2)，68.7 (C-3)，40.5 (C-4)，77.2 (C-5)，83.3 (C-6)，115.8(C-7)，144.5 (C-8)，44.7 (C-9)，38.1 (C-10)，23.0 (C-11)，40.2 (C-12)，44.7 (C-13)，55.8 (C-14)，23.7 (C-15)，28.8 (C-16)，56.8 (C-17)，13.2(C-18)，19.2 (C-19)，41.3 (C-20)，22.0 (C-21)，136.3 (C-22)，133.0 (C-23)，43.7 (C-24)，33.9(C-25)，20.8 (C-26)，20.5 (C-27)，18.5 (C-28)，59.2 (OCH3-6)。以上数据与文献报道的一致［8］，故鉴定化合物5 为(3β，5α，6β，22E)-6-methoxyergosta-7，22-diene-3，5-diol。

化合物6 白色粉末状物质TLC 分析显示该化合物具有甾醇类化合物的特征斑点，与实验室啤酒甾醇标准品进行TLC 分析，采用二氯甲烷:甲醇、石油醚:乙酸乙酯、甲醇:水3 种不同的展开体系展板，其Rf 值均一致，混合点不分离，故确定为啤酒甾醇。

化合物7 白色粉末状物质ESI-MSm/z:135［M-H］-，137［M+H］+，分子式为C8H8O2。1H NMR(500 MHz，MeOD)δ:7.88 (2H，d，J=8.8 Hz，H-2，H-6)，6.84 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3，H-5)，2.52(3H，s，H-8);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:129.6(C-1)，131.6 (C-2，C-6)，115.7 (C-3，C-5)，163.5(C-4)，199.1 (C-7)，25.7 (C-8)。以上数据与文献报道的基本一致［9］，故鉴定化合物7 为对羟基苯乙酮。

化合物8 白色粉末状物ESI-MSm/z:137［MH］-，分子式为C8H10O2。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:6.72 (2H，m，H-2，H-6)，7.03 (2H，m，H-3，H-5)，2.72 (2H，t，J=7.2 Hz，H-1')，3.69 (2H，t，J=7.2 Hz，H-2');13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:156.2 (C-1)，115.6 (C-2，C-6)，130.4 (C-3，C-5)，130.5 (C-4)，38.9 (C-1')，64.1 (C-2')。以上数据与文献报道基本一致［10］，故鉴定化合物8 为酪醇。

化合物9 无色油状物质ESI-MSm/z:391［M+H］+，分子式为C24H38O4。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.71 (2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3，H-6)，7.54 (2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-4，H-5)，4.23(4H，m，H-1')，1.69 (2H，m，H-2');13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:133.3 (C-1，C-2)，131.7 (C-3，C-6)，129.7 (C-4，C-5)，69.0 (C-1')，31.2 (C-2')，39.6 (C-3')，29.8 (C-4')，23.8 (C-5')，14.9 (C-6')，24.6 (C-7')，11.8 (C-8')，168.6 (-COO-)。以上数据与文献报道一致［11］，故鉴定化合物9 为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯。

5 讨论

从菌核青霉FS50 的发酵产物中共分离鉴定出9 个化合物。化合物3 为首次从青霉属中分离得到，化合物2、4、5、6、8、9 为首次从菌核青霉中分离得到。化合物1 和2 为嗜氮酮类化合物，这类化合物具有广泛的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、细胞毒、杀线虫和抗炎等［12］。化合物3为倍半萜类化合物，具有抗肿瘤作用，在25 μg/mL时对MCF-7、SF-268、NCI-H460、HCT-116 和AGS 肿瘤细胞株有抑制作用［13］，此外还有抗真菌，昆虫拒食活性［14，15］。化合物5 和6 为甾醇类化合物，文献报道化合物5 对细胞株A549、SK-OV-3、SK-MEL-2、XF498 和HCT15 具有较好的细胞毒活性［16］。

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