黄花蒿青蒿酸制备及其生物稳定性研究

徐定华，唐雯熙，张晓蓉*，李 杰，刘继旋

1吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室;2 吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000

青蒿酸是黄花蒿(Artemisia annuaL.)植物中倍半萜类成分之一［1-4］，化学构象适宜，具有重要的药用和开发价值，我国资源丰富。研究表明青蒿酸具有较好的抗肿瘤活性，对人肝癌细胞SMMC-7721、人白血细胞K562、白血病P388 等多种癌细胞具有杀伤作用［5，6］。还可减少C/EBPδ mRNA 的水平，抑制hAMSCs 的生脂分化［7］。青蒿酸为青蒿素生物合成重要前体，有望低成本体外转化为青蒿素，近年来青蒿酸制备技术也随之发展，已有多种青蒿酸分离纯化工艺报道，如采用反相高效液相色谱法分离青蒿酸［8］，产物纯度大于96%;采用皂化-硅胶柱层析法从青蒿酸提取母液制备青蒿酸［9］，纯度达95%。也有报道通过单流程工艺制备较高纯度青蒿酸［10］。国外有报道通过酵母转基因技术生物合成青蒿酸。虽然已有多种青蒿酸制备工艺报道，目前青蒿酸尚未实现工业化，一些关键技术还有待解决;有关青蒿酸生物稳定性未见相关报道。青蒿酸分子含有一个羧基，4，5-位以及11-位碳双键易断裂，通过紫外光断裂11-位双键，插入一个甲基和2 个氢，生成二氢青蒿酸，青蒿酸在光氧化条件下氧化其4，5-位双键，生成烯丙过氧氢，提供氯化氢条件，甲酯化生成青蒿酸甲酯，分子中双键使青蒿酸具有一定不稳定性［11-13］。基于青蒿酸重要的开发应用价值，本文探究了溶剂法、吸附分离法制备青蒿酸，对产品进行了表征，分析了青蒿酸的生物稳定性，以期为青蒿酸的工业开发与利用提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

黄花蒿(Artemisia annuaL.)为野外采集，由吉首大学陈功锡教授鉴定。青蒿酸标准品(HPLC ＞99%，批号120628，四川省维克奇生物科技有限公司)。

岛津高压液相色谱仪(LC-10AT，天津岛津液压有限公司)，干燥箱(上海博讯实业有限公司)，申光熔点仪(WRR，上海精科)，紫外分光光度计(天津岛津液压有限公司)，紫外灯(253.7 nm，30 W)，高分辨质谱仪(MAT95XP，美国Thermo Finnigan 公司)，96 孔细胞培养皿，甲醇(HPLC，上海国药)，乙腈(HPLC，上海国药)，其它试剂均为国产分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 青蒿酸制备工艺

将1000 g 黄花蒿植物于60 ℃干燥至恒重，粉碎，过40 目筛，甲醇浸提24 h/次，3 次，植物∶甲醇=1∶10、1∶10、1∶5(g/mL)。合并滤液，浓缩，浸膏乙醚溶解，并加入碱液24 h 反应后，收集碱液层，浓HCl 调pH=1，24 h 反应，再加入乙醚，萃取，收集乙醚，浓缩，浸膏硅胶柱层析分离，收集青蒿酸流份，浓缩，乙酸乙酯溶解浸膏，-20 ℃结晶，收集青蒿酸结晶，真空干燥，备用。

1.2.2 青蒿酸表征

1.2.2.1 青蒿酸溶液配制

精确称量青蒿酸标准品及青蒿酸样品各10 mg，色谱甲醇溶解，容量瓶定量至10 mL，母液浓度为1 mg/mL，备用。实验用青蒿酸标准品溶液及青蒿酸样品溶液均采用色谱甲醇稀释。

1.2.2.1 熔点测定

取5 mg 青蒿酸晶体于50 ℃干燥至恒重，研磨，于熔点仪中测定其熔点，重复3 次。

1.2.2.2 UV-vis 表征

青蒿酸甲醇溶液于比色皿扫描分析，波长范围200～450 nm 扫描，以甲醇为空白对照，测定青蒿酸最大吸收峰。

1.2.2.3 TLC 分析

展层剂:石油醚-乙酸乙酯-丙酮(80∶19∶1，v/v/v);显色剂:香草醛-无水乙醇-浓硫酸(0.5 g∶9 mL∶1 mL);显色温度:100～110 ℃;显色时间:5～10 min。

1.2.2.4 HPLC 检测

精密吸取青蒿酸样品溶液10 μL，注入液相色谱仪，紫外检测器测定峰面积。色谱柱条件:wondas II C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(7∶3，v/v);流速为1 mL/min;柱温为30 ℃，紫外检测波长为203 nm。

青蒿酸浓度计算公式如下:

1.2.2.5 质谱分析

青蒿酸溶解于乙醚溶液用于质谱检测分析。质谱检测条件为毛细管温度180 ℃，喷雾电压5 kV，离子透镜补偿电压15 V，碰撞能量20%～42%，壳气为氮气，毛细管电压38 V，注射泵流速3 μL/min。

1.2.3 生物稳定性检测

光照条件:取三组供试青蒿酸样品溶液，第一组采用自然光照室温保存，第二组用锡箔纸包裹避光室温保存。第三组供试样品溶液分别以每孔300 μL 加入96 孔板，室温紫外灯下照射，光照距离20 cm，取样待检。

温度条件:取三组供试青蒿酸样品溶液，第一组4 ℃条件下避光保存，第二组室温条件下避光保存，第三组60 ℃条件下避光保存，取样待检。

保存时间:供试青蒿酸溶液，室温避光保存。植物样品为野外采集，自然阴干，室温避光贮藏，植物青蒿酸含量检测采用甲醇室温提取，1年保存时间。

HPLC 法检测生物活性，青蒿酸标准品溶液及样品溶液浓度均为0.08 mg/mL。

2 结果与分析

2.1 青蒿酸制备工艺

黄花蒿青蒿酸制备工艺流程如图1 所示。制备工艺设计了有机溶剂提取、反萃取-萃取粗分离、吸附柱分离及结晶、真空干燥等4 个操作单元制备。青蒿酸分子中含有一个羧基，属于极性分子，制备工艺选用极性较强的有机溶剂甲醇提取。青蒿酸呈弱酸性，为弱电解质，工艺采用5% NaOH 皂化及浓HCl 还原，利用反萃取及乙醚萃取粗分离。通过硅胶柱吸附分离法以及石油醚结晶精制，得到青蒿酸产品。通过该工艺产物得到青蒿酸结晶350 mg，制备工艺的产率为61.7%，青蒿酸制备工艺物料平衡及产品收率总结于表1。

图1 青蒿酸制备工艺流程图Fig.1 Preparation process of artemisinic acid

表1 青蒿酸制备工艺物料平衡及产品收率Table 1 Material balance and product yield of artemisinic acid by preparation process

2.2 青蒿酸表征

采用HPLC 法对产物青蒿酸进行了纯度检测，对青蒿酸晶体进行了UV-vis、熔点、TLC、质谱表征，结果如图2 所示。产物青蒿酸纯度为96% (图2 A)。青蒿酸晶体透明，小立方形(图2B 插图所示)。青蒿酸晶体甲醇溶解后，紫外检测表明最大吸收峰为220 nm;青蒿酸结晶熔点为130(132 ℃;TLC 检测表明青蒿酸的Rf值为0.42(图2 C 箭头所示);质谱检测其质子峰为［M］+234(图2 D)，与文献报道一致［1］。

图2 青蒿酸表征Fig.2 Characterization of artemisinic acid

2.3 青蒿酸生物稳定性分析

2.3.1 温度稳定性分析

青蒿酸具有适宜化学构象，不仅可生物转化为青蒿素，且具有重要的药用用途，保持其生物稳定性是其开发利用的前体。因此，探究了4 ℃、室温、60℃等温度条件下青蒿酸生物稳定性。采用TLC 法、HPLC 法对3 种温度条件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 的青蒿酸含量动态变化进行了定性定量分析。TLC 分析结果显示，4 ℃、室温、60 ℃条件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 后青蒿酸斑点清晰可见，Rf值均为0.46(图略)。进一步采用HPLC 法对不同温度条件下保存的青蒿酸含量进行定量检测，结果如图3 A、B、C 所示。由检测结果可知，4 ℃、室温、60 ℃条件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 青蒿酸HPLC 检测保留时间均为12.6 ± 0.2 min。根据公式计算可知，3 种条件下青蒿酸浓度基本保持不变，分别为0.08、0.08 ±0.01 mg/mL 以及0.075 ±0.05 mg/mL，可见青蒿酸在4～60 ℃温度条件下具有较好的生物稳定性。

图3 不同温度保存条件青蒿酸含量HPLC 分析Fig.3 Content analysis of artemisinic acid preserved under different temperatures by HPLC

2.3.2 光稳定性分析

以避光条件为对照，研究了青蒿酸对紫外光及自然光的生物稳定性。TLC 分析结果显示，自然光照条件保存0、12 h、2、5、15、30 d 青蒿酸斑点仍清晰可见，与避光保存青蒿酸标准品斑点显示一致。将青蒿酸进行紫外光照0、2、4、6、8、10、12 h，TLC 检测发现青蒿酸斑点随着紫外照射时间延长，斑点逐渐变小，颜色变淡，6 h 后青蒿酸斑点完全消失(图略)。进一步对自然光及紫外光处理的青蒿酸含量进行HPLC 检测，结果如图4 所示。由图4 A 检测结果可见，自然光照条件下青蒿酸吸收峰与避光保存标准品吸收峰一致，含量稳定，检测浓度保持在0.07～0.08 mg/mL。紫外光照处理后(图4 B)，青蒿酸含量随着紫外光照时间延长逐渐降低，紫外光照2 h 后青蒿酸浓度降为0.04 mg/mL，4 h 后降为0.02 mg/mL，紫外光照8 h 后青蒿酸几乎完全被光解。以上结果表明，自然光照条件下青蒿酸具有较好的稳定稳定性，青蒿酸对紫外光非常敏感。

图4 不同光照保存条件青蒿酸含量HPLC 分析Fig.4 Content analysis of artemisinic acid preserved under different lights by HPLC

2.3.3 青蒿酸保存时间分析

室温避光贮藏条件下，对体外及植物体内保存的青蒿酸生物稳定性进行了分析。HPLC 检测结果如图5 所示。由图5A 检测结果显示，在体外保存1年后，青蒿酸吸收峰与标准品吸收峰一致，含量稳定，浓度保持在0.07～0.08 mg/mL。由图5B 检测结果可知，植物体在自然条件下保存1年后，青蒿酸含量基本稳定，浓度约为1.5%～1.6%，生物稳定性良好。以上结果表明，植物体内外保存一年时间青蒿酸生物活性稳定良好。

图5 植物体内外保存青蒿酸含量HPLC 分析Fig.5 Content analysis of artemisinic acid preserved in and out of plant by HPLC

3 讨论

青蒿酸具有重要的开发利用价值。本文探究了青蒿酸制备工艺，通过该工艺可高效制备青蒿酸产品，纯度达96%。产物青蒿酸紫外最大吸收峰为220 nm，熔点为130～132 ℃，质谱［M］+234。生物稳定性分析表明，4～60 ℃以及自然光照条件下，保存30 d 青蒿酸生物稳定性的保持良好，含量保持0.08 mg/mL 不变。但紫外光对青蒿酸具有极强的破坏作用，紫外照射6 h 后青蒿酸基本检测不出，有报道青蒿酸在紫外条件下，4，5-位以及11-位碳双键断裂发生氧化反应［8］，该结果与文献相符。室温条件下，青蒿酸在植物体内外保存1年含量基本稳定，生物稳定性好。青蒿酸良好的生物稳定性为其开发利用提供了广阔前景。

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