热带作物木莲中生物碱含量的测定

柳泰宇　柳希

【摘 要】生物碱类化合物大多数具有生理活性，往往是许多中草药及药用植物的有效成分。本文以氯仿为溶剂，索氏法提取木莲枝和叶中的生物碱。溴甲酚绿为显色剂，在pH=5.4条件下，采用紫外分光光度法测定其含量。本方法操作简单，结果准确、可靠，重现性好，研究结果为木莲的开发利用提供了科学依据。

【关键词】木莲；生物碱；含量测定

一、前言

生物碱类化合物大多数具有生理活性，往往是许多中草药及药用植物的有效成分。生物碱作为有效成分之一，其含量的高低直接与药材的质量和疗效有关。制定科学合理的提取工艺，保证有效成分生物碱的提取效率，从而有效地控制中药材质量，保证药效是非常重要的。[1]

木莲（Manglietia hainanensis Dandy）为木兰科木莲属植物，在我们海南，木莲被称为龙楠树、绿楠、绿兰等，主要分布于海南定安、保亭、乐东、琼中、陵水、三亚、东方等市县，生于海拔300——1200m的溪边、密林中，是海南特产植物[2，3]，属国家三级植物保护种；文献[4]曾报道过对海南木莲的TLC鉴定研究。木莲属植物民间药用较多，为进一步拓展本属药用植物种类，我们对海南木莲枝和叶中的生物碱含量进行了测定。

从目前的研究来看，对木莲中的生物碱含量测定未曾见有文献报道。对于测定生物碱的含量来说，测定方法有紫外分光光度法，两相滴定法[5]、非水滴定法[6]、HPLC-UV[7]、HPLC-ELSD[8]，GC[9]等。中药材中生物碱提取方法常用的有冷浸取、回流提取、索氏提取和超声波震荡提取等。本实验采用紫外分光光法，测定方法较为普遍，操作简单，准确灵敏的，而生物碱的提取，一般采用索氏提取，因为用索氏提取效果比较好，而且溶液澄清，不需要进行抽滤。

首先进行的是氯仿通过索氏提取将木莲中的生物碱进行提取，配制标准对照品，显色剂和缓冲溶液，测定最大吸收波长，绘制标准曲线，然后对海南木莲中的生物碱进行紫外分光光度测定。为了对该方法的准确度进行研究，还进行了加标回收率和稳定性实验，通过这一部分的实验，可以确定，使用紫外分光光度法测定海南木莲中的生物碱，是准确可靠的。

二、实验部分

（一）仪器、材料与试剂

（1）仪器

PHS-3C型酸度计（上海大普仪器有限公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普析仪器厂）； UV757型紫外可见分光光度计（上海分析仪器厂）；FA1604电子天平（上海精科天平）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；D2F-200 型真空干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；微型植物粉碎机和索氏提取器自制。

（2）材料

海南木莲枝和叶于2009年2月采集于海南省乐东县尖峰岭，自然晾干，粉碎备用。

（3）试剂

盐酸小檗碱（中国药品生物制品检定所，纯度99.99%），溴甲酚绿（上海试剂三厂），邻苯二甲酸氢钾（广州化学试剂厂），柠檬酸（天津市大茂化学试剂厂），柠檬酸钠（广州化学试剂厂），氯仿（天津市富宇精细化工有限公司），浓氨水（广州市番禺力强化工厂），氢氧化钠（天津市百世化工有限公司）等，所用试剂均为国产分析纯。所用水为蒸馏水。

（二）试验方法

（1）缓冲溶液及显色剂的配制

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液：准确称量10.507g 柠檬酸，用蒸馏水溶解于500mL的容量瓶中并定容至刻度，得浓度为0.1mol/L的溶液。准确称量14.705g柠檬酸钠，用蒸馏水溶解于500mL的容量瓶中并定溶至刻度，得浓度为0.1mol/L的溶液，备用。分别取16 mL 0.1mol/L的柠檬酸溶液和34mL 0.1mol/L的柠檬酸钠溶液放置于100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，得pH为5.4的缓冲溶液。

参照文献[10]配制溴甲酚绿指示液：精密称取溴甲酚绿0.125g，用0. 1 mol/L的 NaOH 25. 00 mL溶解后，加入邻苯二甲酸氢钾2.55 g，用少量蒸馏水溶解后，转移至250 mL的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，摇匀备用。

（2）标准品溶液的配制

在电子天平上精密称取盐酸小檗碱10.0mg放入小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，转移到50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到浓度为200μg/mL的标准溶液。

（3）标准曲线的绘制

精密量取浓度为200μg/mL盐酸小檗碱标准溶液0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mL于分液漏斗中，分别标上序号1，2，3，4，5，6。各加水至1.0 mL，用吸量管加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5.0mL，再依次精密加入溴甲酚绿指示液2.0 mL，氯仿10.0 mL，充分振摇1 min，放置分层，静置1h，取氯仿层备用。

另精密量取10.0 mL氯仿，以同样的方法操作制备空白对照液。在波长410 nm处测定氯仿液。以盐酸小檗碱浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

（4）木莲枝和叶生物碱的提取

称取干燥至恒重的木莲叶和枝粉末各10.0g，加浓氨水约3 mL浸湿，拌匀，加氯仿200mL，用索氏提取器提取5h。

将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收部分氯仿后，转移到100mL容量瓶中，用氯仿定容至刻度，得海南木莲叶和枝的生物碱氯仿提取液。

（5）样品中生物碱含量的测定

分别准确量取1.0 mL和0.4mL的枝和叶的提取液置于分液漏斗中，按2.2.3项下的方法操作测其吸光度。根据下述公式进行计算，得木莲叶和枝中的生物碱含量。

（1—1）

（6）精密度实验

准确量取0.4mL叶和1.0mL枝于分液漏斗中，按照2.2.3项下的配制方法，平行测定5次，考察测定方法的精密度。

（7）稳定性实验

精密量取一定体积的标准品溶液，按2.2.3项下的方法制备溶液，在1-90min时间内测定其吸光度变化值，考察标准溶液和样品溶液的稳定性。

（8）加标回收率试验

精密量取已知生物碱含量的海南木莲叶5份，每份0.3 mL，分别准确加入200.0 μg/mL盐酸小檗碱标准溶液0.3 mL，按2.2.3项下的方法制备样品供试液和空白对照液，在波长410 nm处测定。

同法，精密量取海南木莲枝0.5 mL，200.0μg/mL盐酸小檗碱标准溶液0.2 mL进行测定。根据下述公式进行计算，得木莲叶和枝的加标回收率。

（1—2）

三、结果与讨论

（一）最大吸收波长的选择

以氯仿为对照，将标准对照品溶液和空白对照液在350-700nm波长范围内进行扫描。结果显示在410nm有最大吸收值，而空白对照液在410 nm几乎没有吸收，故本实验选择410 nm为测定波长。波长扫描曲线见图1。

（二）工作曲线与回归方程

按2.2.5项下的方法测定，测定数据见表1，绘制标准曲线见图2。

表1 标准曲线测定数据

实验结果表明，标准品盐酸小檗碱溶液在2.0-18.0μg/mL范围内呈现良好的线性关系。得回归方程为：A = 0.03841c - 0.01015； 相关系数r = 0.999 9 （n = 6）。

（三）木莲中生物碱含量的测定结果

按照2.2.5项下的测定方法，得木莲不同部位中的生物碱含量，测定结果见表2和表3。

表2 海南木莲叶中生物碱平均质量分数

表3 木莲枝中生物碱平均质量分数

从测定结果可知，木莲叶中的生物碱平均质量分数为0.450%，RSD=0.838%（n=5），枝中的生物碱平均质量分数为0.0896%，RSD=0.41%（n=5）。结果表明，叶中生物碱的含量更高。

（四）木莲中生物碱含量的测定结果

（1）稳定性实验

按2.2.5项下方法，测定1-90min之间的吸光度，测定结果见图3。结果表明，在本实验的测定时间内，稳定性良好。

表4 稳定性曲线测定数据

（2）加标回收率和精密度实验

从测定结果可知，木莲叶的平均回收率为96.4 %，RSD = 1.4 %（n=5）. 木莲枝的平均回收率为99.6 %，RSD = 0.86 %（n=5）.精密度实验结果见表5，表6.

表5 叶的平均回收率

表6 枝的平均回收率

（五）讨论

木莲中的生物碱的提取运用索氏提取，因为用索氏提取效果比较好，而且溶液澄清，不需要进行抽滤。以盐酸小檗碱为标准对照品，溴甲酚绿为显色剂，在pH=5. 4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液条件下，与溴甲酚绿显色，得到海南木莲不同部位中的生物碱的相对含量。采用紫外分光光法，对木莲中的生物碱进行测定。实验采用紫外分光光度法，是因为该法灵敏度高，准确性好，操作简便，克服了重量法和滴定法均需多次萃取，易造成误差而导致重现性差的不足。同时，该法适于较少量样品的检测。

为了对该方法的准确度进行研究，还进行了加标回收率和稳定性实验，通过这一部分的实验，可以确定，使用紫外分光光度法测定海南木莲中的生物碱，是准确可靠的。

四、结论

本实验利用紫外-分光光度法，测定木莲中的生物碱含量的方法，建立一种操作简单、准确灵敏的生物碱定量分析方法。通过测定，发现木莲叶中的生物碱含量比枝中的要高，本研究结果为木莲的开发利用提供了科学依据。

参考文献：

[1] 赵 骏，齐喜红.生物碱提取方法研究概述.天津中医学院学报[J].2003，22（4）： 43.

[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第30卷第一分册）[M].北京：科学出版社，1996.

[3] 中国科学院华南植物研究所.海南植物志（第1卷）[M].北京：科学出版社.1964.

[4] 毕和平，韩长日，严凤华，等. 海南木莲生药的TLC鉴定[J].海南师范大学学报：自然科学版，2004，17（3）：258-259.

[5] 马利琼，王晓铭，王化远.17个不同产地的川贝母总生物碱的含量测定[J].华西药学杂志，2001，16（1）：60.

[6] 李 萍，曾令杰，李松林.无紫外吸收的贝母总生物碱定量分析方法研究[J].中国药学杂志，2002，37（8）： 614.

[7] Ding K， Lin G， Ho YP. Prederivatization and high-per-formance liquid chromatographic analysis ofbulbus ofFrit-illarial？J Pharm Sc， i 1996， 85（11）： 1174.

[8] 李松林，李 萍，曾令杰.伊犁贝母中西贝素和西贝素苷的高效液相色谱———蒸发光散射检测法[J].药学学报，2001，36（4）： 300.

[9] 程 华，余龙江.分光光度法测定岩黄连不同部位总生物碱的含量[J].时珍国医国药.2006，17（3）： 364.