野生与栽培苦参生物碱含量的比较研究

姚丽+易红+高慧敏+马蕙文+张继远+田莲超+刘晓谦+王智民

[摘要]为比较苦参药材的野生品与栽培品在生物碱成分含量上的质量差异，对收集的22个栽培样本和17个野生样本，用HPLC同时测定了6种生物碱（氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基野靛碱、苦参碱、槐果碱）的含量，以独立样本t检验，辅以聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）方法进行评价。独立样本t检验表明：野生品与栽培品在N-甲基野靛碱、苦参碱、槐果碱3种成分含量上有差异（苦参碱及槐果碱P<0.05，N-甲基野靛碱P<0.01），氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱野含量无差异，但组内差异均较大；聚类分析及主成分分析表明：野生品与栽培品在生物碱含量上无差异。故认为栽培品与野生品在生物碱含量方面无差异。

[关键词]苦参； 野生与栽培； 生物碱

[Abstract]To compare the contents of alkaloids in theroots of cultivated and the wildSophora flavsecens， 22 cultivated and 17 wild samples were collected. HPLC method was employed to simultaneously determine the contents of six alkaloids （oxymatrine， oxysophocarpine， sophoridine，N-methylcytisine， matrine， and sophocarpine）. Independentt-test， hierarchical clustering analysis（HCA）and principal components analysis（PCA）were applied to analyze and evaluate the cultivated and the wildS.flavsecens. With a great wide range of the inter-group， thet-test results showed that the contents difference ofN-methylcytisine， matrine， and sophocarpine were statistical significance（matrineandsophocarpineP<0.05，N-methylcytisineP<0.01）.However， it was not statistically significant for oxymatrine， oxysophocarpine， and sophoridine.HCA and PCA showed that there were no significant differences in the contents of alkaloids of cultivated and wildS. flavsecens. The results indicated that there were no differences in the contents of alkaloids of cultivated and wildS. flavsecens.

[Key words]Sophora flavsecens； cultivated and wild； alkaloid

doi：10.4268/cjcmm20162114

苦参为豆科植物苦参Sophora flavsecensAit.的干燥根，主产于山西、河北、河南等地，其性寒、味极苦，具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等多种药理活性^[1-4]，主要用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下等妇科疾病^[5]。此外，苦参不仅应用到医药行业，也逐步应用到农业、畜牧业及化妆品行业，有韩国研究者将其放入空气过滤器中用来改善空气质量，为天然药物制成空气杀菌剂提供了理论依据^[6-7]。随着苦参需求量的增加，野生资源锐减，栽培品渐渐替代野生品已成趋势；但由于广泛而分散的种植形式，很难形成统一的管理标准，以致各地苦参药材质量不均，品质下降，并由此可能引发相关的安全性等问题。虽有研究表明栽培与野生苦参在清热、利尿及镇痛方面的药理活性相同^[8]，但关于其主要活性成分——生物碱类成分的差异目前尚无报道。

为保证研究结果的数据的可比性、减少气候地理等干扰因素，本研究在苦参样本的采集区域方面作了限定：选择道地产区种植品和栽培品储量均丰富的山西地区作为本研究的样品采集区；以期为道地产区的苦参标准化种植生产和质量保障提供参考。

1 材料

Shimadzu LC 20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT溶液传输单元，SIL-20 A自动进样器，SPD-M20 A二极管阵列检测器，LC Solution色谱工作站（日本岛津公司）。色谱柱Welch Xtimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），KQ-250B超声仪，Mettler Toledo Delta 320 pH计。

乙腈、甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。氧化苦参碱（批号14102450， 纯度≥99.99%）、槐定碱（批号15062213，纯度≥99.22%）、N-甲基野靛碱（批号15072003，纯度≥98%）、苦参碱（批号14112608，纯度≥99.22%）及槐果碱（批号14082711，纯度≥98.52%）均购自北京北纳创联生物技术研究院。氧化槐果碱（批号262.351，纯度≥98%）购自广州隽沐生物科技有限公司。

所有药材均采自山西长治市，经中国中医科学院中藥研究所王智民研究员鉴定为苦参S. flavsecens的干燥根，留样样品储存于本课题组植物标本室。样品的采集信息，见表1， 2。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Xtimate C18（4.6 mm×260 mm，5 μm），流速1 mL·min^-1，柱温30 ℃，检测波长225 nm，流动相乙腈-0.01 mol·L^-1乙酸铵 [3∶2（A）] -0.01 mol·L^-1乙酸铵[（pH 8.1）（B）]，具体色谱方法，见表3，图1。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取苦参药材粗粉约（40目）0.5 g，以氯仿25 mL、氨水0.4 mL为提取溶剂进行提取，超声30 min，称重，氯仿补足失重，滤过，取10 mL 续滤液水浴蒸干，甲醇定容至10 mL，即得。

2.3 对照品溶液的制备 精密称定N-甲基野靛碱，苦参碱，槐果碱，分别2.51，1.27，1.01 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，得到混合对照品溶液1；取氧化苦参碱，氧化槐果碱，槐定碱3种生物碱，精密称定，分别为2.21， 1.01， 0.69 mg于10 mL量瓶，精密加入1 mL混合对照品溶液1，甲醇定容，即得混合对照品溶液2。精密吸取2 mL混合对照品溶液2置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为测定用混合对照品溶液，备用。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取2.3项下混合对照品溶液1， 5， 10， 15， 20， 25 μL注入高效液相色谱仪，以进样量对峰面积进行回归，得到6种生物碱回归方程及线性范围，见表4。

2.5 精密度试验 取同一份苦参供试品溶液连续进样6次，测定氧化苦参碱，氧化槐果碱，槐定碱，N-甲基野靛碱，苦参碱及槐果碱6种生物碱的峰面积，计算RSD。结果各成分峰面积的RSD分别为 0.62%，0.40%，2.8%，2.1%，2.4%，1.8%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份苦参供试品溶液，分别于样品制备后的0，2，4，6，8，10，12，24 h进样，测定峰面积，计算RSD。结果溶液中氧化苦参碱，氧化槐果碱，槐定碱，N-甲基野靛碱，苦参碱，槐果碱6种成分峰面积RSD分别为0.43%，0.40%，2.9%，1.8%，2.2%，2.1%。表明24 h内，供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验 称取苦参（Z-1）药材粉末（40目）约0.5 g共6份，精密称定，按照2.2项下制备样品，测定氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基野靛碱、苦参碱及槐果碱的RSD分别为1.8%，0.73%，0.052%，0.058%，0.054%，0.034%。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的苦参药材粉末约（40目）0.25 g，精密称定，平行6份，分别加入一定量的对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，测定含量并计算各成分的加样回收率。结果表明氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基野靛碱、苦参碱及槐果碱6个生物碱类成分的加样回收率均值分别为99.60%，98.00%，101.3%，97.60%，101.3%，102.8%，RSD分别为1.2%，1.1%，1.1%，2.1%，1.9%，1.8%，表明该方法的准确度良好。结果见表5。

2.9 样品含量测定 分别对22批栽培品和17批野生品按2.2项下制备样品，并测定其含量，结果见表6，7。

3 结果与分析

3.1 两独立样本t检验 采用SPSS20.0软件对所有样本的数据进行独立样本t检验分析， 见表8，通过分析得到所有样品具有方差齐性的特点。对含量高的氧化苦参碱、氧化槐果碱而言，野生品与栽培品之间差异不显著；含量较低的槐定碱、槐果碱、N-甲基野靛碱差异显著，而苦参碱含量虽低，但亦无显著差异。

3.2 聚类分析 采用SPSS 20.0数据处理软件，对长治市不同县苦参野生品与栽培品生物碱的含量进行聚类分析，以比较其品质的差异。为消除原始数据对分析结果的影响，在分析过程中对原始数据进行了标准化处理。聚类方法采用Ward法，距离类型采用欧氏距离（Euclidean）法。聚类结果见图2。

从当欧氏距离为1时，所有样本可以分为4类，每类中均包含有野生样本和栽培样本。当欧氏距离为11时，全部39批样品被聚为两大类，第I类包含5个栽培品和6个野生品，其中栽培品分别分布于潞城市、长治县、武乡县、沁县；野生品主要分布在长治县、平顺县、武乡县及沁县。第Ⅱ类包含17个栽培品和11个野生品，其中栽培品分布地区为长治县、潞城市、屯留县、平顺县、武乡县及沁县。野生品分布于长治县、平顺县、武乡县及沁县。综上，野生品与栽培品混杂聚为不同类别，同时从地理分布方面，亦无明显规律。

3.3 主成分分析 为了进一步评价其生物碱含量差异，分别对该6种生物碱进行了主成分分析，提取特征值大于1的前3个主成分进行分析，第一主成分（PC1）、第2主成分（PC2）和第3主成分（PC3）累积方差贡献率为75.083%。采用方差极大法对因子载荷矩阵实行正交旋转，并绘制旋转后的因子载荷图。PC1主要反映了氧化苦参碱成分的主要信息，PC2，PC3则反映氧化槐果碱和槐果碱的主要信息，旋转后方差贡献率第1主成分为26.814%，第2主成分为25.152%，第3主成分为23.118%。根据得分系数计算长治市野生与栽培苦参3个主成分得分，并绘制散点图，见图3。

由图可知，所有样品被分为4个区域，且4个区域与聚类分析4类成分相对应，每个区域中也都包含野生和栽培品。A中氧化苦参碱（PC1）得分较高，其含量也较高，归为第Ⅰ区域，其余样品归为第Ⅱ区域。第Ⅱ区域分为3小组，B组、C组样品中受氧化苦参碱（PC1）及氧化槐果碱（PC2）含量影响较大，出现交叉现象，D组样品受槐果碱和氧化槐果碱的影响较大，故聚为一类。

在主成分分析中，未能將野生与栽培品分开，相同或相近含量的野生与栽培样品在散点图中多距离较近。该结果与聚类分析结构基本一致。

4 讨论

本文主要对道地产区长治市周边县的野生与栽培苦参的主要生物碱成分含量差异进行了分析。结果表明，所有39批样品均达到2015年版《中国药典》的标准。从外观特征来看，野生与栽培品苦参外观形态无明显差异。尽管独立样本t检验结果表明野生品与栽培品在微量成分上有差异，但由于组内差异较大，无法区分野生品与栽培品。HCA和PCA结果也表明二者在生物碱含量方面无差异。

在野生品与栽培品的质量比较中，为了避免因产区地理、气候、环境等因素对药材质量的影响，对道地产区不同县、乡、村的样品进行实地采集，不仅收集了规范化种植基地、农户种植的样本，而且幸运的是目前仍有一定量的野生品可采挖，保证了质量分析结果的可比性。为了比较不同产区的野生品与栽培品间的差异，仍在收集全国其他主产区的代表性样本，以期得到更大范围、具有可比性的质量数据，为苦参的规范化标准化种植提供科学依据，为精准扶贫做出贡献。

[参考文献]

[1]Liu Y， Xu Y， Ji W， et al. Anti-tumor activities of matrine and oxymatrine： literature review[J].Tumour Biol Nlm， 2014， 35（6）：5111.

[2]郭林丰，童姗姗，余江南. 苦参碱抗肿瘤作用机制研究进展[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（20）： 3409.

[3]张鸣杰，黄建. 苦参碱类抗肿瘤作用机制研究的新进展[J]. 中国中药杂志， 2004， 29（2）： 117.

[4]杨洁，刘萍，武晓玉. 苦参提取物对表皮葡萄球菌的体外抗菌活性研究[J]. 中华医院感染学杂志， 2007， 17（11）： 1357.

[5]中国药典. 一部[S]. 2015：202.

[6]Gi Byoung H， Jung Eun L， Chu Won Nho， et al. Short-term effect of humid airflow on antimicrobial air filters usingSophora flavescens nanoparticles[J]. Sci Totalenviron， 2013， 444： 273.

[7]Jae Hee J， Jung Eun L， Gwi-Nam B. Use of electrosprayedSophora flavescens natural-product nanoparticles for antimicrobial air filtration[J].J Aerosol Sci， 2012， 45 （12）： 1510.

[8]朱晶晶，夏伯侯，王金华，等. 栽培苦参与野生苦参的药效学研究[J]. 中国实验方剂学杂志， 2011， 17（1）： 96.

[責任编辑 丁广治]