不同基因型青花菜游离小孢子培养和植株再生

边立娜+彭永康+孙德岭+单晓政+文正华

摘 要：以5个基因型的青花菜品种为供试材料，采用游离小孢子培养技术，研究基因型对小孢子胚芽诱导和植株再生的影响。结果表明：基因型是影响小孢子胚芽诱导率的重要因子。

关键词：青花菜；游离小孢子；胚状体；植株再生

中图分类号：S635.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.003

Isolated Microspore Culture and Plant Regeneration in Different Genotypes of Broccoli

BIAN Li-na1， PENG Yong-kang1， SUN De-ling2， SHAN Xiao-zheng2，WEN Zheng-hua2

（1.Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，Tianjin 300384，China）

Abstract： Five different genotypes of broccoli were used as experimental materials in this paper and the plant regeneration factors of microspore embryoids and effects of genotypes on embryonic induction rate were studied. The results showed that the genotype was the most important factor on the inducing rate of microspore-derived embryos.

Key words： Brassica oleracea var. italic； micropore culture； embryoid； plant regeneration

收稿日期：2013-10-18；修订日期： 2013-11-02

基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系（CARS-25-A-13）

作者简介：边立娜（1988—），女，天津人，在读硕士生，主要从事细胞生物学研究。

通讯作者简介：孙德岭（1961—），男，河北玉田人，研究员，博士，主要从事花椰菜育种研究。

青花菜（ Brassica oleracea var. italica） ，俗名绿菜花。由于其营养价值高，尤其是在抗癌功能上为同类蔬菜之首，深受消费者青睐。我国青花菜品种多为国外引进，种子昂贵。为培育新的种质资源，育成优质青花菜品种，常规方法需经过杂交、回交和自交分离，选育出理想的材料常常需要好几个世代。而在青花菜育种中利用小孢子组织培养，不仅可快速得到双单倍体纯系，还可大大缩短育种年限[1-4]。自1982年至今，甘蓝型油菜小孢子培养获得胚状体后，国内外利用游离小孢子培养技术在芸薹属作物上相继取得成功[5]，1991年Takahata等[6]首次利用青花菜进行了小孢子培养，随后张德双等[7]、王春丽[1]等也在青花菜游离小孢子培养上取得了成功。虽然小孢子培养技术日趋成熟，但很多学者侧重于对小孢子胚胎发育的诱导因素进行研究，本试验以5个不同基因型的青花菜为材料，对游离小孢子培养与植株再生进行了研究，旨在完善青花菜小孢子培养技术，同时也可为青花菜的遗传育种提供新的材料。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试材料由天津科润蔬菜研究所提供，供试材料于2012年10月定植于天津市科润蔬菜所，采取常规栽培管理，翌年3—4月植株出现花蕾后，选取主花序上的花蕾进行小孢子培养。

1.2 小孢子培养方法

参考张德双等[7]的研究，取处于单核晚期和双核早期的花蕾（4.1～5.0 mm）的小孢子进行培养。小孢子的分离、纯化培养参考赵前程等[8]的方法，用50 g·L-1质量浓度的次氯酸钠溶液进行表面消毒，经无菌水冲洗，用含蔗糖为100 g·L-1的B5培养基进行游离、洗涤，用含蔗糖为130 g·L-1，pH 值5.8，添加6-BA（1 mg·L-1）和NAA（0.1 mg·L-1）的NLN液体培养基进行小孢子培养，并添加一定的活性炭，培养密度为1×105～2×105个·mL-1，热激后，置25 ℃培养箱中继续暗培养，利用倒置显微镜观察小孢子发育进展。

1.3 胚胎发生与胚培养

小孢子受到热激后开始细胞分裂，黑暗培养2周左右，肉眼可见胚状体。30 d左右，胚状体处于子叶期，转移至添加6-BA（0.2 mg·L-1）和NAA（0.02 mg·L-1）的MS培养基上，形成再生芽。

1.4 植株再生与移植

将小孢子的再生芽在MS培养基上进行生根培养，形成完整植株，对试管苗进行增殖培养，扩大植株数量，加快育种，经过驯化移栽到含基质的盆钵中，待小植株成活后，移栽至大田，进行管理。

2 结果与分析

2.1 小孢子离体培养的生长发育观察

经过热激的青花菜小孢子逐渐膨大（图1-A），2周左右，小孢子从多细胞团结构，逐渐发育成球形胚（图1-B）、心形胚（图1-C）、鱼雷胚（图1-D）和子叶胚（图1-E），将子叶胚置于光照下培养5～7 d，可见胚状体萌发，10～15 d左右，形成丛壮苗（图1-F），利用丛壮苗在MS培养基上进行生根培养，7 d左右，可见植株的基部产生大量白色的粗壮的根，形成健壮植株（图1-G）。

2.2 不同基因型小孢子胚诱导的差异比较

由表1可以看出，供试的5个材料中，只有两个形成了小孢子胚，胚胎诱导成功率为40%。不同基因型的小孢子胚诱导成功频率存在差异，11J-52每花蕾平均产胚数达到2.1个，而11J-63仅有0.5个。在未出胚的3个基因型中，11J-150和11J-158都观察到了细胞膨大，11J-173观察到了细胞分裂，说明它们对培养条件产生了反应，但却未能继续发育。由此可见，基因型对小孢子胚胎发育有明显影响。

2.3 小孢子植株再生

再生植株在花球形成期和开花期存在分离情况见图2。11J-52和11J-63两种材料均未采用任何加倍处理，两份材料产生的再生植株只有少部分植株不能表现出十字形花冠，而呈现出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交结角。

3 结论与讨论

利用小孢子培养不仅能够快速有效地获得纯系植株，加快青花菜的育种进程，而且利用单倍体植株的突变来筛选抗病、抗旱、抗虫的青花菜植株显得更加便捷[9]。

基因型是制约小孢子发育的重要因素[10]。在相同的试验条件下，不同基因型诱导小孢子发育的频率差异很大，本研究中，基因型11J-52达2.1个，而11J-63则仅有0.5个，其他3个基因型（11J-150，11J-158，11J-173）则只有细胞膨大和部分细胞分裂，这个结果可以为青花菜游离小孢子培养提供理论依据。但是，关于小孢子培养的启动机制、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的研究仍在探究过程中。

本试验中同时还发现高温热激可以启动小孢子分化，但是，热激又会对小孢子造成一定的伤害，这与一些研究者得出的结果相类似[11]，如何克服这一伤害，找出最适宜的高温预处理方式、处理时间与温度以增加出胚率还有待进一步研究。此外，本试验获得的再生植株均通过自然加倍所得，其可能是单倍体、多倍体及非整倍体构成的混合群体。试验中观察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍体。通过小孢子胚产生的再生植株在农艺性状上的差别与植株倍性之间的联系还有待研究。

参考文献：

[1] 王春丽，王涛涛，张余洋，等.青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究[J].中国蔬菜，2010（4）：36-40.

[2] 方淑桂，陈文辉，曾小玲，等.大白菜游离小孢子培养若干技术研究初报[J].福建农业学报，2003，18（2）：123-126.

[3] 汤青林，宋明，张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展[J].西南农业学报，2000，13（3）：98-103.

[4] 张晓芬，王晓武，张延国，等.花椰菜游离小孢子培养再生植株研究[J].中国蔬菜，2005（1）：16-17.

[5] Lichter R.Induction of haploid plant from isolated pollen of brassica napus[J]. Z Pflanzenhysiol，1982，105（5）：427-434.

[6] Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L[J].Plant Science，1991，74：235-242.

[7] 张德双，曹鸣庆，秦智伟.青花菜游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报，1998，13（3）：102-106.

[8] 赵前程，吉立柱，蔡荣旗，等.花椰菜游离小孢子培养及植株再生研究[J].华北农学报，2007，22（6）：65-68.

[9] 李超，饶勇，陈静，等.单倍体育种技术在油菜育种材料创新上的应用研究Ⅱ.胚状体培育及试管苗越夏[J].种子，2004，23（6）：68-70.

[10] 饶勇，徐涵，毛堂芬，等.单倍体育种技术在油菜育种材料创新上的应用研究Ⅰ.甘蓝型油菜游离小孢子胚状体的诱导发生[J].种子，2003（1）：66-67.

[11] 陆瑞菊，王亦菲，孙月芳，等.提高青花菜游离小孢子培养反应研究[J].上海农业学报，2006，22（2）：1-4.

由表1可以看出，供试的5个材料中，只有两个形成了小孢子胚，胚胎诱导成功率为40%。不同基因型的小孢子胚诱导成功频率存在差异，11J-52每花蕾平均产胚数达到2.1个，而11J-63仅有0.5个。在未出胚的3个基因型中，11J-150和11J-158都观察到了细胞膨大，11J-173观察到了细胞分裂，说明它们对培养条件产生了反应，但却未能继续发育。由此可见，基因型对小孢子胚胎发育有明显影响。

2.3 小孢子植株再生

再生植株在花球形成期和开花期存在分离情况见图2。11J-52和11J-63两种材料均未采用任何加倍处理，两份材料产生的再生植株只有少部分植株不能表现出十字形花冠，而呈现出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交结角。

3 结论与讨论

利用小孢子培养不仅能够快速有效地获得纯系植株，加快青花菜的育种进程，而且利用单倍体植株的突变来筛选抗病、抗旱、抗虫的青花菜植株显得更加便捷[9]。

基因型是制约小孢子发育的重要因素[10]。在相同的试验条件下，不同基因型诱导小孢子发育的频率差异很大，本研究中，基因型11J-52达2.1个，而11J-63则仅有0.5个，其他3个基因型（11J-150，11J-158，11J-173）则只有细胞膨大和部分细胞分裂，这个结果可以为青花菜游离小孢子培养提供理论依据。但是，关于小孢子培养的启动机制、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的研究仍在探究过程中。

本试验中同时还发现高温热激可以启动小孢子分化，但是，热激又会对小孢子造成一定的伤害，这与一些研究者得出的结果相类似[11]，如何克服这一伤害，找出最适宜的高温预处理方式、处理时间与温度以增加出胚率还有待进一步研究。此外，本试验获得的再生植株均通过自然加倍所得，其可能是单倍体、多倍体及非整倍体构成的混合群体。试验中观察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍体。通过小孢子胚产生的再生植株在农艺性状上的差别与植株倍性之间的联系还有待研究。

参考文献：

[1] 王春丽，王涛涛，张余洋，等.青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究[J].中国蔬菜，2010（4）：36-40.

[2] 方淑桂，陈文辉，曾小玲，等.大白菜游离小孢子培养若干技术研究初报[J].福建农业学报，2003，18（2）：123-126.

[3] 汤青林，宋明，张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展[J].西南农业学报，2000，13（3）：98-103.

[4] 张晓芬，王晓武，张延国，等.花椰菜游离小孢子培养再生植株研究[J].中国蔬菜，2005（1）：16-17.

[5] Lichter R.Induction of haploid plant from isolated pollen of brassica napus[J]. Z Pflanzenhysiol，1982，105（5）：427-434.

[6] Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L[J].Plant Science，1991，74：235-242.

[7] 张德双，曹鸣庆，秦智伟.青花菜游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报，1998，13（3）：102-106.

[8] 赵前程，吉立柱，蔡荣旗，等.花椰菜游离小孢子培养及植株再生研究[J].华北农学报，2007，22（6）：65-68.

[9] 李超，饶勇，陈静，等.单倍体育种技术在油菜育种材料创新上的应用研究Ⅱ.胚状体培育及试管苗越夏[J].种子，2004，23（6）：68-70.

[10] 饶勇，徐涵，毛堂芬，等.单倍体育种技术在油菜育种材料创新上的应用研究Ⅰ.甘蓝型油菜游离小孢子胚状体的诱导发生[J].种子，2003（1）：66-67.

[11] 陆瑞菊，王亦菲，孙月芳，等.提高青花菜游离小孢子培养反应研究[J].上海农业学报，2006，22（2）：1-4.

由表1可以看出，供试的5个材料中，只有两个形成了小孢子胚，胚胎诱导成功率为40%。不同基因型的小孢子胚诱导成功频率存在差异，11J-52每花蕾平均产胚数达到2.1个，而11J-63仅有0.5个。在未出胚的3个基因型中，11J-150和11J-158都观察到了细胞膨大，11J-173观察到了细胞分裂，说明它们对培养条件产生了反应，但却未能继续发育。由此可见，基因型对小孢子胚胎发育有明显影响。

2.3 小孢子植株再生

再生植株在花球形成期和开花期存在分离情况见图2。11J-52和11J-63两种材料均未采用任何加倍处理，两份材料产生的再生植株只有少部分植株不能表现出十字形花冠，而呈现出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交结角。

3 结论与讨论

利用小孢子培养不仅能够快速有效地获得纯系植株，加快青花菜的育种进程，而且利用单倍体植株的突变来筛选抗病、抗旱、抗虫的青花菜植株显得更加便捷[9]。

基因型是制约小孢子发育的重要因素[10]。在相同的试验条件下，不同基因型诱导小孢子发育的频率差异很大，本研究中，基因型11J-52达2.1个，而11J-63则仅有0.5个，其他3个基因型（11J-150，11J-158，11J-173）则只有细胞膨大和部分细胞分裂，这个结果可以为青花菜游离小孢子培养提供理论依据。但是，关于小孢子培养的启动机制、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的研究仍在探究过程中。

本试验中同时还发现高温热激可以启动小孢子分化，但是，热激又会对小孢子造成一定的伤害，这与一些研究者得出的结果相类似[11]，如何克服这一伤害，找出最适宜的高温预处理方式、处理时间与温度以增加出胚率还有待进一步研究。此外，本试验获得的再生植株均通过自然加倍所得，其可能是单倍体、多倍体及非整倍体构成的混合群体。试验中观察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍体。通过小孢子胚产生的再生植株在农艺性状上的差别与植株倍性之间的联系还有待研究。

参考文献：

[1] 王春丽，王涛涛，张余洋，等.青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究[J].中国蔬菜，2010（4）：36-40.

[2] 方淑桂，陈文辉，曾小玲，等.大白菜游离小孢子培养若干技术研究初报[J].福建农业学报，2003，18（2）：123-126.

[3] 汤青林，宋明，张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展[J].西南农业学报，2000，13（3）：98-103.

[4] 张晓芬，王晓武，张延国，等.花椰菜游离小孢子培养再生植株研究[J].中国蔬菜，2005（1）：16-17.

[5] Lichter R.Induction of haploid plant from isolated pollen of brassica napus[J]. Z Pflanzenhysiol，1982，105（5）：427-434.

[6] Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L[J].Plant Science，1991，74：235-242.

[7] 张德双，曹鸣庆，秦智伟.青花菜游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报，1998，13（3）：102-106.

[8] 赵前程，吉立柱，蔡荣旗，等.花椰菜游离小孢子培养及植株再生研究[J].华北农学报，2007，22（6）：65-68.

[9] 李超，饶勇，陈静，等.单倍体育种技术在油菜育种材料创新上的应用研究Ⅱ.胚状体培育及试管苗越夏[J].种子，2004，23（6）：68-70.

[10] 饶勇，徐涵，毛堂芬，等.单倍体育种技术在油菜育种材料创新上的应用研究Ⅰ.甘蓝型油菜游离小孢子胚状体的诱导发生[J].种子，2003（1）：66-67.

[11] 陆瑞菊，王亦菲，孙月芳，等.提高青花菜游离小孢子培养反应研究[J].上海农业学报，2006，22（2）：1-4.