低氧对BeWo细胞骨桥蛋白表达的影响＊

夏俊霞， 乔福元， 吉琼梅， 苏放明

1暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院产科，深圳518020

2华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，武汉430030

3深圳市易瑞生物技术有限公司，深圳518000

近年来越来越多的研究［1－2］表明滋养细胞浸润障碍是引起子痫前期（PE）发生发展的关键原因，而子痫前期胎盘缺血缺氧进一步加重了胎盘滋养细胞缺氧，导致滋养细胞功能障碍，形成恶性循环。体外的研究表明低氧可诱导培养的胎盘出现与子痫前期类似的病变［3］。我们的前期研究表明子痫前期胎盘组织骨桥蛋白（osteopontin，OPN）低表达，且随病情加重其表达进一步降低，推测OPN在子痫前期的发病机制中可能发挥重要作用［4－5］。本研究利用气体混配低氧装置，体外模拟子痫前期胎盘缺氧的低氧环境培养滋养细胞，研究低氧对滋养细胞OPN表达的影响，以进一步深入研究OPN在子痫前期发病机制中的作用。

1 材料与方法

1．1 主要试剂

人胎盘绒毛膜癌滋养细胞系BeWo细胞（购自武汉大学典型生物保藏中心）；DMEM／Ham’s F－12K培养液（美国HyClone公司）；免疫组化试剂盒（迈新生物公司）；鼠抗OPN单克隆抗体、鼠抗β－actin单克隆抗体（美国Santa Cruz生物技术公司）；气体混配低氧装置（QT－MTX－3）（长沙长锦科技有限公司）；氧气、氮气、CO2（深特气体）；日本 Olympus倒置显微镜；AB7300实时荧光PCR仪（ABI公司）。

1．2 细胞培养

BeWo细胞在含15%胎牛血清的DMEM／Ham’s F12K培养液中，37℃、5%CO2条件下培养传代，待实验细胞生长融合达到70%时，进行低氧实验。

1．3 低氧实验

1．3．1 低氧装置 低氧装置为气体混配器，配套的培养盒有一进气孔和一出气孔。实验时，将低氧培养的细胞放入相应的培养盒内，由过气孔充入经气体混配器混合后的低氧气体（5%CO2、8%O2、87%N2）或（5%CO2、2%O2、93%N2），10min后密闭培养盒，移入细胞培养箱，37℃继续培养，24h或48h后收集各组细胞，用于后续实验。

1．3．2 实验分组 BeWo细胞分3组培养：①正常对照组，BeWo细胞在正常培养液、常氧浓度下培养；②8%低氧浓度组，BeWo细胞在正常培养液、氧浓度为8%低氧条件下培养；③2%低氧浓度组，Be－Wo细胞在正常培养液、氧浓度为2%低氧条件下培养；8%和2%氧浓度及培养时间参照王岩岩等［6］的实验设计。每组实验均重复3次。

1．4 方法

1．4．1 细胞免疫组织化学法（SABC）检测 BeWo细胞用0．25%胰酶消化后，用F12K完全培养液重悬，调节细胞密度为1×105／mL；在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片，让细胞贴片30min左右；放于37℃、5%CO2培养箱中，不同氧环境下分别培养24h和48h。分别取出培养皿予常规SABC前处理，用于SABC免疫组织化学染色程序。主要步骤为：加血清封闭液37℃下封闭25min；取出甩干封闭液，鼠抗OPN单克隆抗体（1∶200），室温孵育40 min；生物素化羊抗鼠酶标二抗（1∶200）室温孵育45min；SABC室温孵育45min；DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。用抗体稀释液替代一抗进行阴性对照，反应呈阴性。在光学显微镜下随机选取5个高倍视野（×400）观察照相，运用Image－Pro Plus Version 5．1彩色图像分析系统，对每张切片的OPN免疫反应产物进行吸光度值测定，并进行半定量统计分析。

1．4．2 实时荧光定量PCR检测 收集不同氧环境下培养的BeWo细胞，按Trizol法（试剂盒购自Invitrogen公司，美国）提取总RNA。OPN mRNA水平通过实时荧光定量PCR方法检测。引物均根据GenBank登录的人目的基因cDNA序列，由上海英骏公司设计并合成。以β－actin作为内参照同时扩增。各目的基因引物序列、碱基位置、扩增片段长度及PCR扩增时的退火温度见表1。

表1 PCR扩增的2对引物序列及扩增片段的大小Table 1 Two pairs of primer sequences and the size of the amplified fragments in PCR

采用Invitrogen逆转录试剂盒合成cDNA。各基因cDNA的初始量（模板原始浓度）的确定：以标准品的Ct值对初始浓度（相对值）作图（拟合直线），即得标准曲线。反应结束，设置合适的基线（一般是3rd～15th cycle），设置阈值（一般为基线的10倍），获得每个样品的Ct值；也可由软件自动分析，获得每个样品的Ct值。β－actin的表达量是恒定的，用ΔCt法来考查OPN表达的差异。所有实验重复4次，取每个样品的平均Ct值进行分析。以β－actin作为内参照，用2－ΔΔCt方法分析基因表达相对变化结果 RQ（Relative Quantification）。

ΔΔCt＝低氧组ΔCt－常氧组ΔCt；RQ＝2－ΔΔCT

1．5 统计学处理

2 结果

2．1 常氧及低氧培养对细胞形态的影响

低氧培养24h与48h后，分别在显微镜下观察细胞形态改变，低氧24h细胞形态就发生了较大的改变，常氧环境下呈梭形或星形生长的BeWo细胞足突变短（8%O2条件下）甚至消失（2%O2条件下），胞体变圆，并聚集成簇。2%O2环境下生长的细胞形态变化比8%O2环境下更明显（图1），低氧48h与24h比较，细胞形态无明显差别。

2．2 细胞免疫组化检测

2．2．1 光镜观察结果 OPN蛋白在常氧、8%O2及2%O2条件下培养的BeWo细胞中均有表达，可见到OPN免疫反应阳性产物为棕褐色颗粒状或点状，主要表达定位于BeWo细胞的胞质和胞膜中（图2）。

2．2．2 半定量分析 运用Image－Pro Plus Version 5．1彩色图像分析系统进行半定量分析，3组细胞扫描视野和扫描面积比较，差异无统计学意义。与常氧对照组相比，低氧24h，3组OPN的免疫阳性染色无显著性差异（F＝22．04，P＞0．05）；但低氧48h后，8%O2组与2%O2组OPN的免疫阳性染色均变浅，平均吸光度值减小（均P＜0．01），即低氧组细胞OPN的蛋白表达降低，差异显著，同时2%O2组与8%O2组相比，OPN的免疫阳性染色更浅，即2%O2组OPN的蛋白表达低于8%O2组，差异有统计学意义（P＜0．01，表2）。

表2 BeWo细胞OPN免疫反应产物的吸光度测定（±s）Table 2 The absorbance of OPN in BeWo cells treated with different concentrations of oxygen（±s）

表2 BeWo细胞OPN免疫反应产物的吸光度测定（±s）Table 2 The absorbance of OPN in BeWo cells treated with different concentrations of oxygen（±s）

与常氧组比较，＊P＜0．01；与8%O2组比较，△P＜0．01

OPN 免疫反应物吸光度相对值组别2．95±0．18 2．99±0．17 8%O2 2．90±0．18 2．01±0．14＊2%O2 2．89±0．16 1．78±0．12 24h 48h常氧＊△

2．3 实时荧光定量PCR检测

低氧条件下培养的BeWo细胞OPN mRNA表达水平呈不同程度的下降，低氧24h后，8%O2，2%O2组的细胞OPN mRNA表达水平与常氧组相比RQ分别为：0．753 9和0．483 3；低氧48h后，8%O2，2%O2组的细胞OPN mRNA表达水平与常氧组相比 RQ分别为：0．541 2和0．214 0。结果表明，随着低氧时间延长，OPN表达量呈下降趋势，其中以2%O2条件下下降更明显（表3）。

图1 BeWo细胞在不同氧浓度下的培养Fig．1 Culture of BeWo cells under different oxygen concentrations

图2 OPN在不同氧浓度培养的BeWo细胞中免疫反应阳性产物的表达分布（SABC法）Fig．2 The expression of OPN in BeWo cells treated with different concentrations of oxygen（SABC method）

表3 实时荧光定量PCR检测BeWo细胞OPN mRNA的表达Table 3 The expression of OPN mRNA in BeWo cells detected by real－time fluorescent quantitative PCR

3 讨论

3．1 人胎盘绒毛膜癌滋养细胞系BeWo细胞

人类滋养细胞来源的细胞系常用来作为研究滋养细胞功能的细胞模型［7］，这些细胞系大多数来源于恶性葡萄胎或绒毛膜癌的转化细胞，如Jar、Jeg－3和BeWo，这些转化细胞均系滋养细胞来源，在滋养细胞功能方面可提供许多有用的信息。由于获得胎盘原代滋养细胞比较困难，并且在分离和短期应用后，细胞功能会发生一些潜在的变化，因此原代滋养细胞在实验中的应用受到限制。吴维光等［8］的研究证实BeWo细胞可作为一种滋养细胞模型用于低氧与滋养细胞功能关系方面的研究。故本实验采用来源于人类胎盘绒毛膜癌的滋养细胞系BeWo细胞作为研究对象。

3．2 实验性低氧方法

实验性低氧方法有两种，一种是在低氧环境中培养实验细胞或组织，也称为环境低氧；另一种是在细胞或组织培养液中加入铁的螯合剂或二氯化钴，阻断氧信号的转导，模拟低氧信号传给细胞，也称为细胞低氧［9］。环境低氧方法由于需要特殊的培养设备和低氧浓度的混合气体，限制了其在实验中的应用。新近由长沙长锦科技有限公司生产的气体混配缺氧装置（QT－MTX－3）性能与吴维光等［8］研究使用的低氧装置可调式培养箱基本雷同，但其价格便宜，配置气体方便，故本研究中使用气体混配低氧装置（QT－MTX－3）调配需要的氧浓度，进行细胞滋养细胞低氧培养。

3．3 胎盘绒毛的低氧现象与子痫前期

胎盘的功能单位绒毛可分为2种：漂浮绒毛（漂浮在母体血液中）和锚定绒毛（锚定于子宫壁），均由滋养层细胞沿不同的转化途径分化而成。在锚定绒毛中，大多数滋养层细胞保持为单个细胞，并可脱离基底膜相互聚集形成细胞柱。位于滋养层细胞柱远端的滋养层细胞可粘附并侵入子宫壁［10］。在此过程中OPN介导子宫－胎盘界面的细胞粘附和信号转导作用以调节胚胎滋养层侵袭的深度［11］。

在妊娠早期阶段，滋养细胞浸润子宫蜕膜建立胎盘床是一个复杂且难以理解的过程。在此过程中，流向胎盘的血液是相对受限的，故妊娠早期的胚胎发育及胎盘形成是在相对低氧的环境下进行的［12］。母胎界面的滋养细胞的局部氧压随植入进程而变化。胚胎植入早期，绒毛间隙和子宫内膜中的氧压仅为10～40mmHg；随着滋养层细胞对于子宫螺旋动脉的改建，其周围的氧压达到90～100 mmHg，母体子宫内膜和螺旋动脉的改建在孕8～12周达到高峰［10］。由此可见，滋养细胞早期发育是在低氧环境下进行的，随着浸润程度的加深，必将遭受由相对低氧向常氧浓度的转变过程，实际上是胎盘绒毛缺血再灌注的过程，而缺血再灌注会导致活性氧自由基的生成。在病理情况下，绒毛外滋养层细胞浸润表浅，对子宫螺旋动脉的侵入不足致螺旋动脉重铸不良甚至失败，导致胎盘血流灌注不足和缺血缺氧，进一步加重绒毛缺氧，影响整个胎盘的功能，最终导致子痫前期的发生［13］。

3．4 低氧对滋养细胞功能的影响与子痫前期的关系

足月绒毛滋养层细胞在低氧环境下培养48h的电镜观察发现，滋养层细胞内小泡、溶酶体、线粒体增多，并且电子密度较高；细胞表面的微绒毛稀少、变短，分布不均［14］；低氧可增加滋养细胞前列腺素H（PGH）合成酶Ⅱ的表达，而对PGH合成酶Ⅰ的表达无影响，最终增加PGE2及血栓素的合成与释放［15］；将足月胎盘组织在2%O2条件下培养，可显著增加其中合体滋养层细胞肿瘤坏死因子α（TNF－α）、白介素－1α及白介素－1β的生成［16］；这些细胞因子的过量分泌引致内皮细胞损伤失活，与子痫前期的发生密切相关［17］。Soleymanlou等［3］成功证明低氧可以诱导培养的胎盘出现与子痫前期胎盘组织类似的改变，而且在基因表达模式上两者的情形亦相似，推测可能系通过低氧诱导因子引发类似的病变，但具体的作用机制仍然未明。

本研究结果表明：在不同氧浓度的环境下Be－Wo细胞对低氧反应敏感，外观形态在低氧环境下发生明显改变，如足突变短甚至消失，胞体变圆并聚集成簇，BeWo细胞形态的改变直接影响细胞功能的正常发挥；同时亦反映出BeWo细胞在极度缺氧条件下依然可以存活，这与文献报道的相符［18－19］。OPN在各组BeWo细胞中均有表达，其免疫反应产物主要表达定位于胞质和胞膜中，这与Briese等［20］的研究结果一致；低氧对滋养细胞OPN蛋白和mRNA的表达影响呈现出浓度时间依赖性，即随着氧浓度的降低和缺氧时间的延长，OPN表达呈显著下降趋势，类似于OPN在子痫前期胎盘组织的表达随病情加重而进一步降低［4－5］。由此我们推测持续低氧伴随氧浓度的下降导致滋养细胞OPN表达降低，可能是子痫前期胎盘低氧对滋养细胞功能影响的重要机制之一。

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