CXCR4基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定＊

刘星星， 范 恒， 唐 庆， 寿折星， 左冬梅

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉430022

趋化因子受体4（chemokine receptor 4，CXCR4）是基质细胞衍生因子（stromal cell derivedfactor－1，SDF－1）的特异性受体，两者具有高度的亲和力。CXCR4基因定位于人染色体2q21，分子结构上是高度保守的G蛋白偶联的第7跨膜区受体。SDF－1／CXCR4生物轴在细胞间信息传递以及干细胞（stem cells，SC）迁移中扮演着重要角色。研究表明损伤组织部位的SDF－1表达升高，表达CXCR4的干细胞能够沿着SDF－1的浓度梯度迁移实现归巢过程［1］，但同时也有多项研究显示人及鼠类间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）表面几乎都不表达CXCR4［2－3］。如果能有效地提高细胞膜表面的CXCR4表达，就能有效地提高细胞的迁移效率，参与组织修复和重建。本研究中我们利用基因工程技术构建过表达CXCR4基因的慢病毒载体，并进行体外转染以检测其准确性，以期为进一步研究SDF－1／CXCR4轴的生物学功能提供基础。

1 材料与方法

1．1 材料

Primer、250bp DNA ladder Marker购于捷瑞生物公司；GV208载体、pHelper 1．0载体、pHelper 2．0载体、293T细胞、大肠埃希菌菌株DH5α购自上海吉凯基因化学技术有限公司；In－FusionTMPCR克隆试剂盒购于美国Clontech公司；质粒抽提试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶购自新英格兰生物实验室公司；1kb DNA梯状标志购于Fermentas公司；预染蛋白标记物购于中晶公司；琼脂糖购于赛百盛公司；Taq聚合酶购于欣百诺公司；脱氧核苷三磷酸（dNTP）购于美国普洛麦格公司；锥虫蓝购于上海捷倍思基因技术有限公司；胎牛血清、细胞培养液（DMEM）购于Gibco公司；胰酶购于上海化学试剂公司；Lipofectamine 2000购于美国英杰公司；脱氧胸苷酸（Oligo dT）购自上海生物工程公司；第3代大鼠间充质干细胞由华中科技大学同济医院中西医结合研究所赠送。

1．2 方法

1．2．2 CXCR4－GV208质粒构建 用载体构建试剂盒In－FusionTMPCR克隆试剂盒进行克隆重组，将扩增的CXCR4的基因片段插入到慢病毒载体GV208（元件顺序为 Ubi－MCS－EGFP；含增强型绿色荧光标记；克隆位点为AgeⅠ）中。

1．2．3 聚合酶链反应扩增CXCR4基因片段 取正义链引物（10μmol／L）0．4μL，反义链引物（10 μmol／L）0．4μL，5×Taq缓冲液4μL，ddH2O 12．4 μL，dNTPs（2．5mmol／L）1．6μL，模板（10ng／μL）1μL，Taq聚合酶0．2μL，混匀，94℃，5min，然后反复94℃30s，55℃30s，72℃2min循环30次，72℃10min后取出冷却至室温，获得CXCR4基因片段。

1．2．4 酶切消化GV208载体 取纯化的GV208质粒（1μg／μL）2μL，AgeⅠ 酶（5U／μL）1μL，10×缓冲液5μL，ddH2O 42μL，将上述液体缓慢混合后置于37℃，2h，获得线性化的GV208载体。

1．2．5 扩增的CXCR4基因片段交换入线性化GV208表达载体 设计分组为：GAPDH组，对照组以及 CXCR4组。反应体系为：ddH2O（13．5、16．5、13．5μmol），10×In－Fusion交换酶缓冲液（每组 各 2 μmol），In－Fusion 交 换 酶 （每 组 各 0．5 μmol），线性化GV208载体DNA（每组各1μmol），纯化后CXCR4基因片段（3、0、3μmol）。反应条件：混合后25℃，30min，然后42℃，15min。

1．2．6 阳性克隆的PCR鉴定 PCR鉴定引物为CXCR4－P3（5′－CTGACTATCCCTGACATCATC－3′）；EGFP－N－R （5′－CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG－3′），PCR方法同1．2．3。阳性对照为 GAPDH内参基因，鉴定出阳性转化子，接种后37℃培养16h并保存为甘油菌，分装200μL送测序。

1．2．7 慢病毒包装 将 DNA 混合液 （CXCR4－GV208 20μg，pHelper 1．0载体15μg，pHelper 2．0载体10μg）与 Opti－MEM 2．5mL 混匀，室温 5 min，稀释后的DNA与Lipofectamine 2000混匀，室温20min，将混合液转移至293T细胞培养液中，37℃、5%CO2环境中培养，8h后换液，20mL PBS洗涤，加入含10%胎牛血清的培养液25mL，继续培养48h，收集转染后48h的293T细胞上清。4℃，4 000g离心10min，过滤上清于过滤器中，4 000g离心15min，收集病毒浓缩液于－80℃保存。

1．2．8 慢病毒滴度检测 采用RT－qPCR法，抽提病毒感染的293T细胞的总RNA，总RNA的抽提根据美国英杰公司的试剂盒操作说明书进行。RNA逆转录获cDNA根据美国普洛麦格公司的M－MLV操作说明书进行。GFP上游引物：5′－TGCTTCAGCCGCTACCC－3′，下 游 引 物 序 列：5′－AGTTCACCTTGATGCCGTTC－3′，Actin（NM ＿001101）上 游 引 物：5′－GTGGACATCCGCAAAGAC－3′，下游引物序列：5′－AAAGGGTGTAACGCAACTA－3′。RT－qPCR 检测在日本宝生物公司（TaKaRa）的TP800上完成。通过比较对照组和样品组的Ct值差异判断滴度值，通常认为Ct值相差2以上存在显著差异。

1．2．9 慢病毒转染MSC细胞 将3代MSC进行胰酶消化，制成细胞悬液，将细胞悬液（细胞数约为4×105）接种于24孔培养板中，37℃、5%CO2培养箱培养至细胞融合度达到约80%，根据美国英杰公司Lipofectamine 2000转染试剂使用说明书进行转染操作。以20的感染指数（multiplicity of infection，MOI）转染MSC，48h后观察GFP基因的表达情况。

2 结果

2．1 PCR扩增CXCR4基因片段及鉴定阳性克隆

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，基因片段的大小为1 138bp，与预期一致（图1）。将扩增的目的基因CXCR4交换入线性化GV208载体后，进行PCR鉴定（图2），结果表明，阳性转化子PCR产物大小约为680bp，与预期相符。

2．2 阳性克隆测序结果

将构建的重组载体阳性克隆送美国英杰公司进行DNA测序分析。与GenBank上的CXCR4基因标准序列进行分析比对显示：Identities＝1 047／1 047（100%），Gaps＝0／1 047（0%），结果说明：显示含有与设计相同的靶序列，表明已正确构建重组质粒（图3）。

图1 CXCR4基因片段的PCR扩增Fig．1 Amplification of the gene fragments of CXCR4by PCR

图2 CXCR4重组载体的PCR鉴定Fig．2 Identification of the CXCR4recombinants by PCR

2．3 慢病毒滴度检测

在本次滴度检测中，10－4μL组和对照组样品的Ct值存在2个左右差异（表1），所以认为在10－4μL组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1／（1．0×10－4）×20＝2．0×105TU／μL＝2．0×108TU／mL。

表1 不同剂量病毒感染后样品组的Ct值及表达量分析Table 1 The Ct value of samples after transfection with lentiviruses at different concentrations and the analysis of expression quantity

2．4 慢病毒转染MSC效率

慢病毒转染MSC 48h后，荧光显微镜下可观察到细胞内及细胞膜表面都有明显的绿色荧光表达，表明慢病毒成功转染MSC并使其成功表达出CXCR4－GFP融合蛋白（图4）。

3 讨论

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。MSC是一种存在于骨髓中的非造血干细胞，易于体外培养扩增，并在培养过程中保持多分化潜能，其具有遗传背景稳定，体内植入排斥反应较弱等特点，所以被认为是一种用于组织工程和细胞治疗的理想细胞［4］。MSC移植作为一种新的治疗方法能治疗炎症介导的多种疾 病［5－6］。有研 究证实，静脉注射MSC能够显著减缓炎症性肠病的症状，抑制炎症因子分泌，提高IL－10的表达，同时抑制Th1细胞活性［7］。虽然MSC在再生医学中具有很大的应用潜力，但是也有大量研究表明系统释放的MSC到达受损组织的效率是非常低下的，循环中的MSC大部分停留于肺血管床［8］。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，通过自身RNA为模板在反转录酶的作用下合成双链DNA，并通过整合酶作用将目的基因整合到宿主染色体上。慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，同时不受细胞分裂影响，其可以在体内较长期地表达且安全性高，因此在基础实验研究中具有广阔的应用前景［9］。本研究中的慢病毒载体系统由GV208载体、pHelper 1．0载体、pHelper 2．0载体组成。GV208慢病毒载体中含有HIV的基本元件5′LTR和3′LTR及其他的辅助元件，可根据不同的实验目的对GV208载体进行改造并用于基因功能研究。pHelper 1．0载体中含有gag基因、pol基因和rev基因，分别负责编码病毒主要的结构蛋白、编码病毒特异性的酶和编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper2．0载体中含有VSV－G基因（来源于单纯疱疹病毒），提供病毒包装所需要的包膜蛋白［10］。上述载体均为假型病毒，病毒感染目的细胞后不再具有感染能力，也不会在宿主细胞内产生新的病毒颗粒［11］。因此该慢病毒系统具有较好的安全性、靶向性。该慢病毒技术已经广泛地应用于多领域研究［12－13］。

图3 克隆序列与CXCR4基因标准序列比对（部分）Fig．3 Contrast of the gene sequence alignment between the cloning sequence and the standard of CXCR4（Only apart is presented）

图4 携带CXCR4／GFP慢病毒转染MSCFig．4 Transfection of LentivirusCXCR4／GFPinto MSC

SDF－1α是趋化因子亚家族成员之一，它在药物的趋化作用、干细胞归巢以及肿瘤转移中扮演着重要作用［14］。依靠其局部高浓度，SDF－1能招募循环中的白细胞到达炎症或受损组织，从而发挥治疗目的［15］。CXCR4属于G蛋白偶联的7次跨膜的趋化因子受体，在体内许多细胞，尤其在造血干／祖细胞的表面均有CXCR4的构成性表达。目前认为SDF－1α是CXCR4的唯一生理配体，CXCR4也是SDF－1的唯一受体，两者的亲和力很高［16］。有研究显示SDF－1能特异地对CXCR4产生趋化作用，表达CXCR4的干细胞能够沿着SDF－1α的浓度梯度迁移实现归巢过程［17］。Masafumi等［18］证实在心肌梗死部位的SDF－1表达升高，并能够有效地吸引表达CXCR4的骨髓来源细胞（包括内皮祖细胞）到达梗死部位促进血管生成。大量研究表明虽然MSC低表达CXCR4，其也能通过SDF－1／CXCR4轴，有效地迁移至受损的骨髓或心肌，提高MSC膜表面的CXCR4表达将成为改善MSC迁移的一个重要途径［19－20］。由此可见提高CXCR4的表达是基础及临床研究的迫切需要。本实验通过重组慢病毒技术成功构建了过表达CXCR4基因的慢病毒载体并成功感染MSC。同时该慢病毒载体技术能够共表达增强型GFP，GFP能够用来有效示踪MSC在活体内的迁移［21－23］。有研究者成功地应用慢病毒技术使目的细胞过表达CXCR4来治疗各种疾病［24－25］。

目前应用该慢病毒系统构建过表达CXCR4的研究尚未见报道，本实验成功构建了重组CXCR4－GV208慢病毒载体，为进一步研究CXCR4的生物学功能提供新的途径，为进一步促进MSC迁移和归巢等研究打下良好的实验基础。

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