气体信使H2S对MPP＋所致PC12细胞损伤的保护作用及其机制＊

杨 燕， 常 飞， 曹 旭， 经 屏

1武汉市中心医院神经内科，武汉430014

2暨南大学附属深圳市人民医院神经内科，深圳518020

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是以黑质多巴胺能（Dopamine，DA）神经元变性死亡为主要病理改变的神经系统退行性疾病，其病因尚不明确，年龄、遗传、毒素、氧化应激损伤等均被认为参与了发病。学者们认为氧化应激损伤可能是多巴胺能神经元变性的最后共同途径［1－2］，因此如何减轻氧化应激来保护多巴胺能神经元是治疗帕金森病的重要策略。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）作为一种气体分子，早在20世纪80年代末，学者们在大鼠、人的脑组织中就检测到内源性H2S存在，这提示H2S可能具有较重要的生理作用［3］。1996年Abe和Kimura［4］首次通过实验证明内源性H2S可能是一种神经活性物质。随后大量研究发现，H2S是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后存在于体内的第3个新型气体信使（gasotransmitter），它广泛参与哺乳动物多系统生理和病理过程的调节。但其对PD中多巴胺能神经元损伤的保护作用及其机制仍不清楚。本研究拟观察H2S供体NaHS对PD细胞模型损伤有无保护作用，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1．1 细胞培养及处理

PC12细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心。PC12细胞使用含5%胎牛血清、10%马血清的高糖DMEM培养液在5%CO2、37℃的培养箱中培养，隔天换液，当单层培养细胞汇合后传代。

1．2 实验分组

空白对照组：正常培养，不给予任何处理试剂；MPP＋组：500μmol／L的 MPP＋单独处理PC12细胞24h；MPP＋＋NaHS组：按NaHS剂量分为50、100、200、400μmol／L 4组，各组均以 NaHS预处理30min后再予500μmol／L的MPP＋处理24h。每组各设定5个标本（n＝5）以进行统计学分析。

1．3 CCK8（Cell Counting Kit－8）法检测细胞活力

以4×104／孔（100μL／孔）左右的密度将PC12细胞接种于96孔板，置37℃、5%CO2细胞培养箱24h，每孔加5mg／mL的CCK8工作液10μL（YEASEN，Japan），37℃孵育3h后以全自动酶标仪（BioTek synergy2，USA）在450nm 波长下检测各孔的吸光度值（A）。细胞存活率的计算公式为：细胞活力（%）＝［A（加药）－A（空白）］／［A（0加药）－A（空白）］×100。注：A（加药）：具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培养液和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

1．4 Hoechst 33342染色检测细胞凋亡

PC12细胞接种至孔内预置玻片的24孔细胞培养板，按前述分组经药物处理完成后，取出含有单层细胞的玻片，加入0．5mL多聚甲醛固定10min，以5μg／mL的 Hoechst33342（碧云天公司，上海）0．5 mL染色并室温避光孵育10min，用PBS洗2遍，加1滴封片液后在荧光显微镜下观察并拍照，激发波长为350nm，每组计数200个细胞，计算凋亡率。

1．5 细胞内ROS含量的检测

将各组细胞培养于96孔板，完成造模后吸净细胞培养液，加入适当体积10μmol／L DCFH－DA液，37℃孵育20min后用无血清DMEM／F12培养液洗涤3次，将96孔板置入全自动酶标仪（BioTek synergy2，USA）内，设定激发波长为488nm，发射波长为525nm，读取各孔内细胞ROS水平，结果以与对照组ROS含量的百分比表示。

1．6 PC12细胞总谷胱甘肽（GSH）含量检测

PC12细胞按106个／盘接种于60mm培养皿中，待分组处理完毕后PBS洗涤细胞1次，离心收集细胞，吸尽上清，按总谷胱甘肽检测试剂盒（碧云天公司，上海）加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂S溶液，振荡混匀，利用液氮和37℃恒温水浴锅对样本进行2次快速的冻融，然后在冰上放置5 min，10 000r／min低温离心10min，取上清用于总GSH的测定。准备好的上清依次加入96孔板，每孔中加入150μL总GSH检测工作液后混匀，室温孵育5min，加入50μL 0．16mg／mL的NADPH 溶液混匀，将96孔板置入全自动酶标仪内，在405～414nm附近范围测定吸光度，对照标准曲线计算总GSH含量，以nmol／mg protein为单位表示。

1．7 线粒体膜电位（ΔΨM）的检测

PC12细胞接种至24孔细胞培养板，按前述分组经药物处理完成后，加入JC－1染色工作液（5mg／L），细胞培养箱中37℃孵育20min，然后用JC－1染色缓冲液洗涤2次，加入细胞培养液。使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置在荧光显微镜下检测红色、绿色荧光强度，以了解ΔΨM变化。正常线粒体呈红色荧光，当ΔΨM下降时呈绿色荧光。

1．8 Nrf2在PC12细胞及胞核中的表达检测

用EDTA分别消化收集各组细胞，PBS清洗2次，用细胞核蛋白与细胞总蛋白抽提试剂盒（碧云天公司，上海）按说明书提供步骤分别抽提PC12细胞核蛋白和胞质蛋白，蛋白与上样缓冲液混匀后煮沸变性10min，用Bradford法测定蛋白浓度。

每个蛋白样本分别取20μg经聚丙烯酰胺凝胶电泳（建成生物公司，南京），60mA×1．5h电转移至硝酸纤维素膜（Pell公司，USA），TBST漂洗3次，含有5%脱脂奶粉的TBST常温封闭1h，TBST充分洗涤后，一抗孵育过夜。各种抗体来源和孵育浓度如下：Nrf2抗体（1∶5 000；Abcam公司，UK），β－actin抗体（1∶2 000；Santa Cruz公 司，USA），Lamin B抗体（1∶2 000；Santa Cruz公司，USA）。一抗孵育完成后TBST漂洗3次，辣根过氧化物酶结合的二抗（博奥森公司，北京）常温孵育1h，TBST充分洗涤后以ECL法显色并拍照。NIH图像软件分析各条带吸光度，结果以与对照组吸光度值的百分比表示。

1．9 统计学处理

全部实验数据由SPSS 13．0软件包进行统计学分析。检测结果以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，结果的相关性用各时间点测定指标的均数行线性相关分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 H2S减少MPP＋导致的PC12细胞活力下降

以CCK8法检测细胞活力的结果显示，经500 μmol／L MPP＋单独处理24h后PC12细胞活力下降至（47．69±8．23）%。与 MPP＋单独处理组相比，不同浓度的 NaHS（50、100、200、400μmol／L）预处理使各组细胞活力分别上升到了（52．39±7．53）%，（61．02±10．66）%，（70．98±9．52）% 和（69．94±5．02）%，均 明 显 高 于 MPP＋组 （P＜0．05），见图l。而200μmol／L NaHS与400μmol／L NaHS处理组间比较，其对细胞存活率的改善并无显著性差异（P＞0．05），考虑高浓度H2S可能存在细胞毒性作用，400μmol／L也许是其保护作用和损伤作用的临界点，后续实验均选取200μmol／L为NaHS预处理浓度。

图1 H2S对PC12细胞存活率的影响Fig．1 Effects of H2S on the survival rate of PC12cells

2．2 H2S减少MPP＋所致PC12细胞凋亡

Hoechst 33342染色后，正常细胞核呈圆形、淡蓝色；而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色或核呈分叶、碎片状、边集（图2）。500μmol／L MPP＋处理PC12细胞24h后，Hoechst 33342染色可见部分细胞出现亮蓝色，细胞凋亡率为（48．46±8．27）%，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05）。而200μmol／L的NaHS处理后，凋亡的细胞核形态学改变有所改善，细胞凋亡率明显降低，与 MPP＋组比较差异有统计学意义（P＜0．05，图2）。

图2 H2S对PC12细胞凋亡的影响（×100）Fig．2 Effects of H2S on the apoptosis rate of PC12cells（×100）

2．3 H2S减轻MPP＋所致PC12细胞氧化应激损伤

我们以ROS生成量、细胞GSH含量及线粒体膜电位来评估细胞的氧化应激水平。500μmol／L MPP＋处理24h，可使PC12细胞产生大量的ROS。200μmol／L的NaHS预处理可拮抗ROS的形成，酶标仪所读取的荧光值明显降低。对照组细胞GSH 含 量 为 （15．66±2．17）nmol／mg protein，MPP＋损伤后GSH含量下降至（4．96±1．32）nmol／mg protein，NaHS预处理能显著减轻 MPP＋损伤导致的GSH耗竭，见表1。

表1 H2S对PC12细胞ROS和GSH含量的影响（n＝5，±s）Table 1 Effects of H2S on the ROS and GSH levels of PC12cells（n＝5，±s）

表1 H2S对PC12细胞ROS和GSH含量的影响（n＝5，±s）Table 1 Effects of H2S on the ROS and GSH levels of PC12cells（n＝5，±s）

与对照组比较，＊P＜0．01；与 MPP＋组比较，＃P＜0．05

组别 ROS（%对照组） GSH（nmol／mg protein）100．00±11．66 15．66±2．17 MPP＋ 237．83±18．66＊ 4．96±1．32＊MPP＋＋NaHS 146．53±21．72＊＃ 9．73±3．01＊＃对照组

2．4 H2S改善MPP＋所致PC12细胞线粒体膜电位下降

正常线粒体内，JC－1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC－1只能以单体的形式存在于胞质中，产生绿色荧光。如图3所示，与对照组的PC12细胞线粒体膜电位（图3A1～A3）相比，500μmol／L MPP＋单独处理组PC12细胞绿色荧光明显增强，提示ΔΨM显著下降，线粒体能量耗竭（图3B1～B3）。而200μmol／L的NaHS处理后红色荧光较MPP＋组增加，提示H2S改善了MPP＋所致的线粒体损害（图3C1～C3）。

图3 NaHS预处理对MPP＋所致线粒体膜电位的影响（×400）Fig．3 Effects of pretreatment with NaHS on the mitochondrial transmembrane potential of PC12cells（×400）

2．5 H2S促进PC12细胞Nrf2核转位

Western blot检测结果表明，正常对照组PC12细胞的Nrf2主要在胞质中表达，胞核中表达水平较低；在MPP＋的单独处理下，PC12细胞总Nrf2和胞核的Nrf2含量都出现了减少（P＜0．05，图4），可能是 MPP＋处理导致 Nrf2降解；而200μmol／L NaHS预处理组中，总Nrf2含量下降与MPP＋单独处理组差异无统计学意义；但NaHS预处理可显著减少胞核的Nrf2表达下降，其胞核Nrf2含量为（79．66±10．87）%，明显高于 MPP＋组（54．12±9．24）%（P＜0．05，图4），提示 H2S可能促进 Nrf2核转位。

图4 NaHS预处理对PC12细胞Nrf2表达的影响（n＝5）Fig．4 Effects of pretreatment with NaHS on the Nrf2expression in PC12cells（n＝5）

3 讨论

1996年Abe和Kimura［4］首次通过实验证明内源性H2S可能是一种神经活性物质。随后，大量研究表明，内源性H2S在神经系统、消化系统、心血管系统等均有重要的生理作用，引起了科学家们广泛的兴趣和重视。目前，H2S被证实是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后存在于体内的第3个新型气体信号分子或称气体信使（gasotransmitter），具有许多与NO相似的生理功能，例如扩血管、促凋亡和抑制增殖等［5］，广泛参与哺乳动物多系统生理和病理过程的调节。研究提示，H2S能通过多条途径清除氧自由基，减弱脂质过氧化反应，减少过氧化反应产物的聚积，扩张冠脉，提高心肌灌注，改善缺血性心肌损伤［6－8］；外源性给予生理浓度的 H2S可显著减轻ONOO－和谷氨酸介导的神经细胞氧化损伤［9－10］；阿尔茨海默病中，H2S水平的下降与痴呆的严重程度呈正相关，H2S降低致神经元的抗氧化保护作用减弱可能是阿尔茨海默病的发病机制之一［11］。

本研究采用经典方法以MPP＋处理PC12细胞构建PD细胞模型，观察H2S供体NaHS对于PD细胞损伤有无保护作用。结果显示，当以50、100、200μmol／L的NaHS预处理PC12细胞后可以部分逆转MPP＋所致PC12细胞存活率下降，并减少细胞凋亡，但400μmol／L的NaHS并没有展现出比200μmol／L的NaHS更强的细胞保护作用。我们推测这与H2S浓度增高可能会带来细胞毒性作用有关，但其机制有待于进一步探索。我们选用200μmol／L的NaHS进行后续的研究，这也与其他H2S相关研究使用的NaHS浓度接近。

200μmol／L的 NaHS预处理可明显降低MPP＋所致PC12细胞ROS生成，细胞内大部分ROS都是在线粒体内代谢产生，并通过线粒体呼吸链复合物进行调节，大量ROS生成和聚集，使得线粒体膜通透性增加，进而影响到细胞的正常结构与功能并导致细胞凋亡的发生。我们同时也发现200 μmol／L的NaHS在维持线粒体膜电位的稳定性方面也呈阳性表现。

那么H2S通过何种途径抑制氧化应激损伤呢，我们把目光放在了细胞内源性抗氧化系统上。其中，Nrf2通过调节ARE驱动多种Ⅱ相解毒抗氧化酶表达［12－13］，目前被认为是调控多种抗氧化酶转录表达的关键内源性通路［14］。我们的研究显示在MPP＋的单独处理下，PC12细胞总Nrf2和胞核的Nrf2含量都出现了减少，我们推测可能是MPP＋损伤后导致了Nrf2降解。有趣的是，200μmol／L的NaHS预处理并没有明显改善MPP＋所致总Nrf2含量的下降，提示H2S并不能提高Nrf2的表达水平，但NaHS预处理组中胞核Nrf2含量却较MPP＋单独处理组升高，说明H2S是通过促进Nrf2核转位发挥作用的。正常情况下，Nrf2与其分子伴侣Keap1相结合，以相对失活状态存在于胞质中。当Keapl被亲核物质或活性氧攻击，或者某些化学信号刺激后，Nrf2就会与Keap1发生解偶联并进入细胞核内［15－16］，增进 ARE 依赖的抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录活性。由此我们认为一定量的H2S可以刺激Nrf2从Keap1解离并核转位，但是其在Nrf2－Keap1复合物上的激活靶点上如何发挥化学作用，有待于进一步探索。

综上所述，我们的研究提示，H2S可以通过促进内源性细胞内源性抗氧化系统活性改善PD细胞模型的氧化应激状态，以减少ROS生成，稳定线粒体膜电位，最终减少细胞死亡。本研究为气体信使H2S预防MPP＋对PC12细胞的神经毒性作用提供了体外实验依据，为进行PD动物实验研究提供了药理学靶位。

［1］ Onyango I G．Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease［J］．Neurochem Res，2008，33（3）：589－597．

［2］ Miller R L，James－Kracke M，Sun G Y，et al．Oxidative and inflammatory pathways in Parkinson’s disease［J］．Neurochem Res，2009，34（1）：55－65．

［3］ Warenycia M W，Goodwin L R，Benishin C G，et al．Acute hydrogen sulfide poisoning．Demonstration of selective uptake of sulfide by the brainstem by measurement of brain sulfide levels［J］．Biochem Pharmacol，1989，38（6）：973－981．

［4］ Abe K，Kimura H．The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator［J］．J Neurosci，1996，16（3）：1066－1071．

［5］ Zhao W，Zhang J，Lu Y，et al．The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATPchannel opener［J］．EMBO J，2001，20（21）：6008－6016．

［6］ Galagudza M，Kurapeev D，Minasian S，et al．Ischemic postconditioning：brief ischemia during reperfusion converts persistent ventricular fibrillation into regular rhythm［J］．Eur J Cardiothorac Surg，2004，25（6）：1006－1010．

［7］ Tsang A，Hausenloy D J，Mocanu M M，et al．Postconditioning：a form of“modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3－kinase－Akt pathway［J］．Circ Res，2004，95（3）：230－232．

［8］ Silva G，Jeney V，Chora A，et al．Oxidized hemoglobin is an endogenous proinflammatory agonist that targets vascular endothelial cells［J］．J Biol Chem，2009，284（43）：29582－29595．

［9］ Whiteman M，Armstrong J S，Chu S H，et al．The novel neuromodulator hydrogen sulfide：an endogenous peroxynitrite scavenger［J］．J Neurochem，2004，90（3）：765－768．

［10］ Kimura Y，Kimura H．Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress［J］．FASEB J，2004，18（10）：1165－1167．

［11］ Eto K，Asada T，Arima K，et al．Brain hydrogen sulfide is severely decreased in Alzheimer’s disease［J］．Biochem Biophys Res Commun，2002，293（5）：1485－1488．

［12］ 曹旭，肖海兵，杨燕，等．Nrf2活化剂SFP对MPP＋所致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用［J］．华中科技大学学报：医学版，2013，42（2）：143－147．

［13］ Moi P，Chan K，Asunis I，et al．Isolation of NF－E2－related factor 2（Nrf2），a NF－E2－like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF－E2／AP1repeat of the beta－globin locus control region［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（21）：9926－9930．

［14］ Copple I M，Goldring C E，Kitteringham N R，et al．The Nrf2－Keap1defence pathway：role in protection against drug－induced toxicity［J］．Toxicology，2008，246（1）：24－33．

［15］ 邢红霞，杨大飞，刘胜，等．6－羟多巴胺及囊泡单胺类转运功能抑制对PC12细胞凋亡的影响［J］．华中科技大学学报：医学版，2012，41（4）：427－430．

［16］ Zhang D D，Hannink M．Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1－dependent ubiquitination of Nrf2and for stabilization of Nrf2by chemopreventive agents and oxidative stress［J］．Mol Cell Biol，2003，23（22）：8137－8151．