WWOX、p53及Bcl－2在鼻咽癌中的表达及意义＊

兰会华， 莫武宁， 黄华艺

1广西壮族自治区人民医院检验科，南宁 530021

2广西医科大学第一附属医院临床医学实验中心，南宁 530021

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病机制不十分清楚，治疗效果不令人满意，因此，寻找鼻咽癌相关的分子标志物，成为一个重要的研究方向。

WWOX（WW结构域含有氧化还原酶）是新发现的抑癌基因［1］，其表达异常在多种肿瘤中频繁出现。研究指出WWOX基因不仅上调p53表达，也下调凋亡抑制因子Bcl－2和Bcl－XL的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡［2］。为了研究鼻咽癌中涉及的变化，我们探讨WWOX基因与p53和Bcl－2在鼻咽癌组织中的表达及其相互作用。

1 材料与方法

1．1 病例来源

收集广西医科大学第一附属医院耳鼻喉科初诊、有完整临床及病理资料的鼻咽癌患者鼻咽组织61例，所有的标本均经病理证实，均未经过化疗及放疗。参照 WHO的标准，晚期病理诊断依据TNM分期法进行分期，收集同期鼻咽黏膜慢性炎症（CIONM）组织20例作对照。标本离体后部分置－80℃冰箱保存，部分经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，贴于涂有0．05%多聚赖氨酸的载玻片备用。

1．2 实验材料

Trizol购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司，引物合成及PCR试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，兔抗人WWOX多克隆抗体（ab33248）购自美国Abcam公司，兔抗人p53单克隆抗体（ZA－0501）及鼠抗人Bcl－2单克隆抗体（ZM－0010）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1．3 RT－PCR检测

用Trizol提取组织RNA，用逆转录试剂盒提供的标准条件进行逆转录反应，所获取的cDNA作为PCR反应模板，用Actin作为cDNA的内参照，cDNA用于WWOX基因引物的PCR扩增，WWOX引 物 （正 向，5′－GAGTTCCTGAGCGAGTGGAC－3′；反向，5′－CCCCAGGAATTCCCTGCTT－3′），扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性60s，64℃退火60s，72℃延伸90s，变性、退火和延伸共33个循环，最后72℃延伸10min。cDNA用于p53基因引物的PCR扩增，p53引物（正向，5′－GAAACTACTTCCTGAAAACAACGT－3′；反 向，5′－GCCTCACAACCTCCGTCAT－3′），扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸45s，变性、退火和延伸共33个循环，最后72℃延伸10 min。cDNA用于Bcl－2基因引物的PCR扩增，Bcl－2引物（正向，5′－GACGCTTTGCCACGGTGGTG－3′；反 向，5′－GGGGCAGGCATGTTGACTTCAC－3′），扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，变性、退火和延伸共33个循环，最后72℃延伸10min。扩增完成后，用1．5%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，全自动凝胶成像电泳分析仪下观察结果并进行照相，用Gel－pro Analyzer 4．5凝胶定量分析软件分析各扩增条带产物的含量。

1．4 免疫组织化学法检测

按照说明书进行实验，按标准方法进行石蜡包埋组织的免疫组织化学染色，显微镜下，对所测区域进行定位后，在相同显微镜条件下采集图像，用Image－Pro Plus 5．1彩色图像分析软件分析图像，统计累积吸光度值／测量面积，即平均吸光度值（A值）。

1．5 统计学方法

应用SPSS 13．0软件包对数据进行统计和分析，实验数据用±s表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用方差分析，相关性检验采用Pearson相关分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 WWOX、p53及Bcl－2mRNA的表达情况

为了解 WWOX、p53和Bcl－2的转录情况，对81例鼻咽黏膜慢性炎症和鼻咽癌组织mRNA表达进行研究，在肿瘤组织中WWOX mRNA扩增产物较正常组织减低或缺失（图1A），而p53和 Bcl－2 mRNA扩增产物较鼻咽黏膜慢性炎症组织增高（图1B、1C）。

2．2 WWOX、p53及Bcl－2蛋白免疫组织化学染色

应用相应的抗体对81例组织进行免疫组织化学染色分析，观察WWOX、p53和Bcl－2蛋白在鼻咽癌中的表达，结果表明，在鼻咽癌组织中WWOX蛋白表达显著弱于鼻咽黏膜慢性炎症组织（图2A、2B），在鼻咽癌中p53和Bcl－2蛋白表达明显增强（图2C～2F）。

图1 WWOX、p53and Bcl－2mRNA在鼻咽癌及对照组组织中的表达Fig．1 The expression of WWOX，p53and Bcl－2mRNA in NPC and CIONM tissues

图2 WWOX、p53和Bcl－2蛋白在鼻咽癌及对照组中的表达（免疫组织化学染色，×400）Fig．2 The expression of WWOX，p53and Bcl－2protein in NPC and CIONM tissues（Immunohistochemical staining，×400）

2．3 WWOX、p53和Bcl－2的表达情况

数据显示，WWOX mRNA及蛋白在鼻咽癌组表达明显低于鼻咽黏膜慢性炎症组（均P＜0．05），p53和Bcl－2mRNA及蛋白在鼻咽癌组中表达明显强于鼻咽黏膜慢性炎症组（均P＜0．05）（表1）。

表1 WWOX、p53及Bcl－2mRNA及蛋白在鼻咽癌和黏膜慢性炎症组织中的表达（A，±s）Table 1 The mRNA and protein expression of WWOX，p53and Bcl－2in NPC and CIONM tissues（A，±s）

表1 WWOX、p53及Bcl－2mRNA及蛋白在鼻咽癌和黏膜慢性炎症组织中的表达（A，±s）Table 1 The mRNA and protein expression of WWOX，p53and Bcl－2in NPC and CIONM tissues（A，±s）

与鼻咽癌组织比较，＊P＜0．05＊＊P＜0．01

蛋白WWOX 鼻咽癌基因 组别 n mRNA 61 0．69±0．34 0．14±0．02鼻咽黏膜慢性炎症 20 0．89±0．49＊ 0．16±0．02＊＊p53 鼻咽癌 61 0．88±0．59 0．35±0．07鼻咽黏膜慢性炎症 20 0．51±0．21＊＊ 0．21±0．04＊＊Bcl－2 鼻咽癌 61 0．44±0．32 0．30±0．04鼻咽黏膜慢性炎症 20 0．24±0．11＊ 0．24±0．03＊＊

2．4 WWOX、p53和Bcl－2蛋白表达与相关临床因素的关系

为了进一步探讨 WWOX、p53和Bcl－2基因在鼻咽癌的发生发展中的作用，本研究对 WWOX、p53和Bcl－2在肿瘤不同临床分期、有无淋巴结转移、不同性别、年龄以及病理类型中的蛋白水平表达情况进行了分析，WWOX蛋白表达与鼻咽癌的临床分期和有无颈部淋巴结转移有关，WWOX蛋白在癌症的Ⅰ～Ⅱ期表达要高于Ⅲ～Ⅳ期（P＜0．01），在无淋巴结转移组要高于有淋巴结转移组（P＜0．05）。p53蛋白表达在Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0．05），Bcl－2 蛋 白 在 鼻 咽 癌 中的表达与TNM分期、淋巴结转移、性别、年龄及病理分型无关（均P＞0．05）（表2）。

表2 WWOX、p53及Bcl－2蛋白表达与鼻咽癌相关临床因素的关系（A，±s，n＝61）Table 2 The relationship between the protein expression of WWOX，p53and Bcl－2and the clinical features of NPC（A，±s，n＝61）

表2 WWOX、p53及Bcl－2蛋白表达与鼻咽癌相关临床因素的关系（A，±s，n＝61）Table 2 The relationship between the protein expression of WWOX，p53and Bcl－2and the clinical features of NPC（A，±s，n＝61）

组内比较，＊P＜0．05＊＊P＜0．01

临床因素 WWOX p53 Bcl－2分期I＋Ⅱ期 0．15±0．02 0．32±0．07 0．28±0．03Ⅲ＋Ⅳ期 0．13±0．02＊＊ 0．37±0．07＊0．30±0．04颈部淋巴结转移性别年龄0．13±0．02 0．35±0．07 0．30±0．03无0．15±0．02＊ 0．35±0．07 0．29±0．05有0．14±0．02 0．35±0．07 0．29±0．04女0．13±0．02 0．35±0．08 0．30±0．03男＜40岁 0．14±0．03 0．33±0．06 0．29±0．03 40岁～ 0．13±0．03 0．37±0．09 0．29±0．03 50岁～ 0．13±0．02 0．37±0．07 0．30±0．04病理分型0．14±0．02 0．33±0．08 0．32±0．05低分化磷状细胞癌 0．13±0．02 0．36±0．06 0．29±0．03磷状细胞癌Ⅲ级 0．14±0．03 0．36±0．10 0．31±0．04非角化癌（未分化型） 0．14±0．02 0．32±0．06 0．29±0．04非角化癌（分化型）

2．5 WWOX与p53和Bcl－2蛋白的相关性分析

为分析WWOX蛋白与p53和Bcl－2蛋白的关系，对WWOX与p53和Bcl－2在蛋白水平的表达进行相关分析，数据显示，在鼻咽癌组织中WWOX与p53表达之间有负相关关系（r＝－0．62，P＝0．008），WWOX与Bcl－2表达也呈负相关关系（r＝－0．45，P＝0．008）。

3 讨论

WWOX（WW结构域含有氧化还原酶）是新近发现在FRA16D常见的染色体脆性位点上含大于1M碱基对的基因组区域的基因，据报道，在几种不同来源的肿瘤细胞株中WWOX基因存在低表达、缺失或异常转录［3］，WWOX基因编码1个含有2个WW区域和短链脱氢酶还原酶区域的46kD的蛋白质，WW结构域通常是由一个40个氨基酸组成的球状结构域，其中的2个色氨酸和1个高度保守的脯氨酸，就如SH3结构域一样，WW结构域的特点是与含脯氨酸配体介导的蛋白质相互作用，通常，根据其与配体结合的情况，WW区域可以分为4个等级，近来，有人认为他们可以通过酪氨酸磷酸化来调节［4］。

研究认为，WWOX作为一种癌抑制基因，与肿瘤的发生、发展和预后密切相关，其表达异常在多种肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、食管癌，肺癌及胃癌中频繁出现。本研究中，WWOX转录在鼻咽黏膜慢性炎症组织中表达正常但在鼻咽癌组织中WWOX转录明显减少或缺失，这表明在鼻咽癌中WWOX在转录水平已有改变。虽然DNA和RNA很重要，但是决定基因功能的实际因素是其蛋白的表达水平，为进一步探讨，本研究采用免疫组织化学染色技术检测蛋白表达情况，发现在鼻咽癌组织中 WWOX蛋白表达也低于鼻咽黏膜慢性炎症组织，在鼻咽癌组织中WWOX mRNA和蛋白表达减少或缺失，因此，WWOX基因可能在肿瘤中起着重要的作用。另外，研究还发现，在鼻咽癌中WWOX蛋白与鼻咽癌的不同临床分期及有无颈部淋巴结转移相关，在癌症早期WWOX的表达高于晚期，在有淋巴结转移的病例表达率低于无淋巴结转移者，提示WWOX的减低或缺失可能参与调控鼻咽癌的发生、发展。

p53是体内重要的抑癌基因，p53基因作为一个完整基因组的保护者，在细胞凋亡的调控中起着至关重要的作用，p53基因的改变广泛存在于人类肿瘤中。在细胞损伤后，突变的p53基因导致p53蛋白合成的改变使其无法控制DNA修复和细胞凋亡的激活，这将导致DNA持久损害［5］。在多种人类肿瘤中，p53基因突变频率在50%～70%，但在鼻咽癌中p53基因突变频率低于10%［6］。大量的研究显示，60%以上的鼻咽癌组织和几乎100%的鼻咽癌细胞株中存在p53过表达，具体机制目前还不清楚［7－8］。本研究中鼻咽癌组p53mRNA表达水平明显高于鼻咽黏膜慢性炎症组，与张猛等［9］报道相符，本研究数据显示p53蛋白在鼻咽癌组织中呈过表达，鼻咽癌晚期p53蛋白表达明显高于早期，这提示p53的过表达在鼻咽癌的发生发展中起着重要的作用。

Bcl－2基因是迄今研究最深入的凋亡调控基因之一，负责调节凋亡信号的后期阶段［10］，过表达的Bcl－2可避免细胞的程序性死亡，该蛋白质在致癌作用中至关重要。在大多数恶性肿瘤中，肿瘤细胞Bcl－2的表达显著高于良性肿瘤细胞和正常细胞，Sheu等［11］研究发现，在鼻咽癌组织中，Bcl－2蛋白呈高表达，另外在不典型增生上皮上也呈高表达，这说明Bcl－2蛋白在鼻咽癌发生的早期阶段扮演了重要角色。本研究发现Bcl－2mRNA和蛋白在鼻咽癌组织中的表达高于鼻咽黏膜慢性炎症组织，Bcl－2蛋白的阳性表达在鼻咽癌早期和晚期、有无淋巴结转移、各病理分型中的阳性表达分别进行比较，差异无统计学意义。在一定程度上说明Bcl－2的异常表达是细胞癌变的较早期事件，与鼻咽癌的转移和预后关系不大。

考虑到其肿瘤抑制效应的基本机制，一些研究认为WWOX不仅上调p53表达，而且也下调凋亡抑制因子Bcl－2和Bcl－XL蛋白的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，基于本课题的研究结果我们推测WWOX基因在鼻咽癌中可能发挥抑癌基因的功能，经进一步分析，WWOX与Bcl－2的蛋白表达呈负相关关系，这证实了在肿瘤中WWOX下调Bcl－2的表达，而本课题中WWOX与p53蛋白呈负相关关系，这与其他癌症的研究中 WWOX基因上调p53的表达不相符，也许是因为在鼻咽癌中p53突变频率低于10%，但却存在过表达有关，但其具体机制尚不清楚，有待进一步研究。总之，三者在鼻咽癌的发生发展中可能具有协同作用，共同促进了鼻咽癌的生长和转移，但是目前还缺乏有关 WWOX与p53、Bcl－2基因在肿瘤中的相关性调控机制的相关文献报道，这些有待进一步研究探讨。

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