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乙型肝炎病毒X蛋白升高细胞内钙离子机制研究*

2014-01-01何生松刘亚男姚景宏

关键词:内钙琼脂糖内质网

王 君, 何生松, 刘亚男, 张 盼, 姚景宏

华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科,武汉430022

原发性肝细胞性肝癌(HCC)是最常见的原发恶性肿瘤之一,死亡率极高,其中乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是其主要致病因素[1-3]。在 HBV引发的HCC中,HBV的病毒表达产物乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白起着重要的作用[4]。HBx蛋白作为细胞的反式激活因子可以调节很多细胞信号传导通路,可以调节细胞质Ca2+离子浓度,其与细胞的增殖有关[5-6]。肝细胞作为非兴奋性细胞,不表达电压依从性钙通道(voltageoperated calcium channels,VOCs),Ca2+通透性受体调节通道(ROCs)和通透性钙池调节离子通道(SOCs)是调控其细胞内钙离子浓度[Ca2+]i的主要通道。现已证实,SOCs在维持由激素诱导的原代肝细胞钙振荡中发挥重要作用[7]。目前认为 ROCs引起的[Ca2+]i升高是一个瞬时变化,不足以维持细胞的长期反应,SOCs则可持续升高[Ca2+]i,而[Ca2+]i持续升高是胞内多种激酶激活的必要条件[8]。SOCs被内质网内腔Ca2+浓度降低激活而开放,生理作用在于补充内质网的Ca2+而避免钙库Ca2+耗竭。间质相互作用因子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)及钙释放激活钙通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1,Orial)是目前已确定的肝细胞SOCs组成蛋白[9],STIM1为内质网Ca2+浓度感受器,Orail是SOCs在细胞膜上的孔蛋白。目前HBx蛋白如何调节细胞内钙离子机制不清,本研究从HBx蛋白与SOCs相关蛋白着手,探讨HBx蛋白调节细胞内钙离子的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293(ATCC中心,Manassas,USA);携带HBx全 长 基 因 的 pcDNA-Flag-HBx 质 粒、携 带Orai1全长基因的pcDNA-HA-Orai1质粒、携带STIM1全长基因的pcDNA-HA-STIM1质粒(从NIH神经实验室Prof.Lutz Birnbaumer处获得);Fura-2/AM、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);细胞培养液 DMEM、HBSS、PBS、胎牛血清、BSA(Gibco公司);蛋白质 Marker(晶美生物有限公司);胰蛋白酶、鼠单克隆HBx抗体、鼠单克隆HA抗体、鼠单克隆myc抗体、羊抗鼠多克隆抗体(Sigma公司);ECL显色试剂盒(默克公司);毒胡萝卜素(thapsigargin,Calbiochem公司);谷胱甘肽巯基转移酶琼脂糖珠 (GST-Beads,Amersham Biosciences公司);倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HEK293细胞用含10%胎牛血清和1% 青霉素-链霉素的高糖DMEM培养液,并置于37℃、5%CO2培养箱内,待细胞贴壁生长达80%~90%融合度时,预热的PBS清洗细胞;预热的胰蛋白酶消化细胞,加3mL DMEM 培养液(含10%FBS)以终止消化反应,并将细胞悬液转移入10 mL离心管中;1 000r/min,离心5min,去除上清;加入10mL DMEM 培养液(含10%FBS),重新悬浮细胞,使细胞充分打散;进行细胞计数,根据细胞计数结果,将适当数量的细胞悬液转至6孔培养板中(细胞密度6×104个/mL);置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 当细胞生长状态良好且贴壁细胞密度达到70%~80%时进行转染;在Lipofectamine 2000介导下,将pcDNA-Flag-HBx、pcDNA-HA-Orai1、pcDNA-HA-STIM1及空载质粒各2.5μg转染或共转染 HEK293细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱孵育5h后去除含脂质体复合物的培养液,加入2mL含10%血清的DMEM培养液,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48h。

1.2.3 co-IP实验 转染HEK293细胞48h后,吸走培养孔中培养液,用PBS洗涤2次,加入预冷的细胞裂解液(含cocktail蛋白酶抑制剂)1mL,细胞刮收集细胞;超声裂解细胞;4℃,8 000r/min,离心15min,取上清。取30μL含有Flag蛋白的琼脂糖珠(Flag-beeds)或 HA 蛋白的琼脂糖珠(HA-beeds),用预冷的 RIPA 缓冲液洗3遍,12 000r/min,离心1min,并用RIPA缓冲液配制成1∶1琼脂糖珠悬浮液。将琼脂糖珠悬浮液加入到已收集的细胞裂解液中,4℃层析柜旋转孵育4h。在4°C,以12 000r/min,离心3min,将琼脂糖珠悬浮液离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠悬浮液用预冷的RIPA缓冲液洗3遍,800μL/遍;最后加入35μL 2×SDS上样缓冲液,将上样样品水浴95℃,5min,蛋白变性。取适量表达蛋白样品上样后,用10%的SDS-PAGE电泳分离,然后转印于PVDF膜上,用含5%的脱脂奶粉TBST室温封闭蛋白印迹膜l h,加入一抗即鼠单克隆HA抗体或Flag抗体,4℃孵育过夜。用TBST振摇洗涤3次,10min/次,加入二抗即羊抗鼠IgG,室温孵育2h,接着用TBST振摇洗涤3次,10min/次,用ECL显色,暗室胶片曝光显影。

1.2.4 GST pull-down实验 将编码蛋白 Orai1及Orai1C末端(257~301aa)与GST的重组质粒GST-Orai1及GST-CT转化到BL21(DE3)菌株(本实验室已制备)。分别挑取单个克隆到含有5mL LB(+100μg/mL Amp)的10mL细菌培养管中,37℃培养过夜。将培养菌液转移到含有500mL LB(+100μg/mL Amp)的1L锥形瓶中,37℃,225r/min培养至A600达0.6~0.8左右,加入终浓度1 mmol/L的IPTG,30℃,225r/min诱导3h;8 000 r/min,5min 4℃离心收集细菌,去尽上清,置于冰上,每500mL培养液加入10mL细菌裂解液(PBS+1%Triton-100+PMSF),吹打混匀。冰上超声破碎,开4s,停6s,总30min,至裂解液充分清亮。4℃,12 000r/min,离心15min,取上清,-80℃保存备用。将pcDNA-myc-HBx质粒转染 HEK293细胞。转染48h后,收集细胞,提取目的蛋白。同时分别取500μL融合蛋白GST-Orai1及GST-CT冰上冻融;分别取2管 GST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中,50μL/管,用800μL PBS+1%Triton-100润洗3次,分别将冻融融合蛋白GST-Orai1及GST-CT与之混匀,4℃层析柜旋转结合1h。PBS+1%Triton-100洗3次;用10%BSA封闭30min,再用PBS+1%Triton-100洗2次。取50μL已纯化myc-HBx蛋白裂解液,加入50μL 2×SDS上样缓冲液,水浴95℃,5min,蛋白变性。其余myc-HBx蛋白裂解液样品加入到预处理过的GST-Beads的EP管中,4℃层析柜旋转结合3h;用PBS+1%Triton-100洗3次。用30μL 2×SDS上样缓冲液溶解beads上的蛋白,水浴55℃,10min,蛋白变性。高速离心,取适量表达蛋白样品上样后,用12%的SDS-PAGE电泳分离,然后转印于PVDF膜上,用含5%的脱脂奶粉TBST室温封闭蛋白印迹膜l h,加入一抗即鼠单克隆myc抗体,4℃孵育过夜,用TBST振摇洗涤3次,10min/次,加入二抗即羊抗鼠IgG,室温孵育2h,接着用TBST振摇洗涤3次,10min/次,用ECL显色,暗室胶片曝光显影。

1.2.5 细胞内钙离子检测 取已预先放入细胞爬片的6孔板,接种HEK293细胞悬液2mL(细胞密度6×104个/mL),置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养,待细胞贴壁生长达80%时,分别用pcDNAGFP-HBx,pcDNA-HA-Orai1,pcDNA-GFP-EV,pcDNA-HA-STIM1质粒共转染 HEK293细胞。转染48h后,吸走培养液,用PBS轻柔地洗涤1次,加入含2μmol/L Fura-2/AM 的细胞培养液1mL,37℃避光孵育25min,让荧光染料充分进入细胞;随后取出细胞爬片,固定在灌流槽上,室温下,用无钙HBSS洗3次;将灌流槽放置在钙离子测量/成像系统的倒置显微镜载物台上,分别用波长为340nm和380nm的单色光去激发染色后的细胞使之发出荧光,选择细胞区域后,每次选择25~30个细胞,用电荷耦合器件(CCD)采集荧光强度和荧光图像,F340/F380荧光比值代表细胞内钙离子的浓度变化。起始用微量进样器小心加入含有EGTA的HBSS,观察它对所测细胞内荧光强度的影响;200s后,加入含有2μmol/L毒胡萝卜素的HBSS,使钙库钙离子耗竭;然后加入含2mmol/L Ca2+的 HBSS,诱导钙池操控的钙内流(SOCE)。

1.3 统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件处理数据,测定结果以均数±标准差(±s)表示,两组数据间均数比较采用配对t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养与转染

细胞培养状态良好,转染后的细胞状态良好,使用激光共聚焦显微镜观察转染率为30%~40%(图1)。

2.2 co-IP实验

结果显示实验组细胞内HA标记的Orai1蛋白可以与Flag标记的HBx蛋白免疫共沉淀,而对照组不发生免疫共沉淀(图2)。表明HBx蛋白可以与细胞膜钙离子通道Oria1蛋白结合,产生相互作用。

图1 激光共聚焦显微镜观察HEK293细胞转染情况Fig.1 Laser confocal microscopy of transfection of HBx gene into HEK293cells

图2 co-IP实验验证在细胞内HBx蛋白与Orai1蛋白结合情况Fig.2 co-IP assay demonstrating the intracellular interation between HBx protein and Orai1

2.3 GST pull-down实验

为进一步确定HBx蛋白与细胞膜钙离子通道Oria1结合蛋白相互作用的具体部位,收集蛋白进行 GST pull-down实验,结果显示 Orai1-CT 末端(257~301aa)可以特异性地和 HBx蛋白结合,Orai1-NT(1~71aa)末端及 Orai1-loop结构域(141~173aa)不与HBx蛋白结合,对照组无结合,见图3。

图3 GST pull-down实验检测HBx蛋白与Orai1蛋白相互作用部位Fig.3 GST pull-down assay of the interacting domain between Orai1and HBx proteins

2.4 细胞内钙离子检测

为明确HBx蛋白与Orai1结合后对SOCE影响,共转染 pcDNA-GFP-HBx,pcDNA-HA-Orai1,pcDNA-GFP-EV,pcDNA-HA-STIM1 质 粒 到HEK293细胞。转染后的细胞加入荧光探针Fura-2/AM后使用毒胡萝卜素耗竭存储在细胞内的钙离子,然后加入Ca2+,诱导SOCE。结果显示转染HBx的细胞与转染空载质粒的对照组相比较,Fura-2/AM 荧光比率 F340/F380高于对照组,表明HBx可增加细胞钙内流,转染 HBx+Orai1+STIM1的细胞与转染Orai1+STIM1或者HBx的细胞相比F340/F380比率增高更明显,细胞钙内流更加明显(图4),SOCE产生后,在700s时间点左右,细胞内钙离子浓度最高,表达HBx+ Orai1+STIM1的细胞与Orai1+STIM1过表达的细胞相比较,可显著增加细胞内钙离子浓度(P<0.01)。

图4 细胞内钙离子检测证实HBx蛋白可增加细胞钙内流Fig.4 Single-cell calcium measurement revealed that HBx protein could increase the intracellular calcium

3 讨论

HBV感染在我国是HCC的最主要致病原因,绝大部分HCC患者合并有HBV感染[2]。HBx基因编码的HBx蛋白具有强大的恶性转化能力,可以诱导HCC的发生,并增加其恶性表型,导致肿瘤的预后不良[10-11]。我们注意到,HBx无论是在促进HBV复制,还是在诱导肝细胞恶性转化过程中,常需要首先激活钙离子信号,引起细胞内钙信号失稳。已研究证实,HBx通过升高细胞内钙离子浓度激活PyK2和FAK激酶是 HBV复制的必要条件[6,12]。HBx在升高[Ca2+]i同时激活细胞JNK和 MAPK信号途径,并促进细胞增殖[13]。因此,钙信号在HBx发挥功能中起重要作用。

钙离子是重要的细胞内第二信使,参与细胞的多种生理病理过程[14]。肝细胞在生理浓度的激素作用下可引起[Ca2+]i持续升高或振荡[7],在生理状态下,钙离子信号调节肝细胞的多种生理功能。[Ca2+]i升高需要细胞外钙离子内流,SOCs是肝细胞等非兴奋性细胞钙离子内流的主要通道[15-16]。当内质网钙池中的钙离子释放后,既可激活细胞膜上的SOCs,引起钙内流。胞膜蛋白Orai1和内质网膜蛋白STIM1是与SOCs密切相关的蛋白,其中Orai1蛋白是33kD的膜蛋白,又称为CRACM1(calcium-release-activated calcium modulator 1)。基因敲除Orai1能显著降低细胞钙池操控的钙离子内流(SOCE)或钙离子释放激活的钙电流(ICRAC)[17]。当内质网内的Ca2+释放后,内质网上的STIM1与胞膜上的Orai1相互作用,形成四聚体,在胞膜上形成高选择性孔道引起钙内流,即SOCE或ICRAC[18]。Orai1激活引起的钙内流持续时间长,振幅大,可激活转录因子AP-1、CREB及NFAT等参与细胞活化、增殖、迁移等。

目前关于HBx蛋白调节细胞内钙离子平衡的机制有线粒体方面的报道,Gearhart等[19]研究发现HBx通过开放或者关闭线粒体通透性转换孔(MPTP)而增加细胞内的钙内流。但是内质网是细胞内重要的钙离子存储库,目前还无HBx蛋白与内质网及钙离子关系的报道,本研究采用co-IP实验,从细胞内研究HBx蛋白与SOCs相关蛋白的关系,结果显示细胞内HBx蛋白可以与Orai1蛋白相互作用。使用GST pull-down实验明确HBx蛋白与Orai1蛋白结合的具体部位,结果显示HBx蛋白可以与Orai1的C末端(257~301aa)结合,进一步确定了HBx蛋白与Orai1蛋白作用的具体部位。细胞内钙离子检测结果显示Orai1+STIM1+HBx过表达细胞,钙离子增加最明显,证实HBx蛋白通过与Orai1蛋白结合从而增加细胞内钙内流,当细胞内钙离子被耗竭时,细胞内Orai1过表达,细胞内钙内流增加更加明显。因此,我们可以推测,HBx蛋白可以通过与Orai1蛋白的C末端结合,扰乱细胞内[Ca2+]i的稳态,影响其细胞周期,导致肝细胞异常增殖,可能参与肝细胞恶性转化过程。此研究与前期研究结果有所不同,Gearhart等[19]是从线粒体方面揭示HBx蛋白干扰细胞内钙离子平衡机制,而本研究从SOCs相关蛋白着手,探讨HBx蛋白调节细胞内钙离子平衡具体机制,从分子水平揭示HBV感染导致HCC的机制,该研究结果将为HCC的防治提供理论基础。本研究针对HBx蛋白的功能,探讨其诱发肝细胞恶性转化的新机制,为开展肝癌的防治提供新的实验依据。

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