蛋清中溶菌酶提取技术的研究

赵喜乔 赵荣昊 张梦熙 吴汉东

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种葡萄糖苷酶。它是英国细菌学家弗莱明于1922年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质。溶菌酶的发现是近代酶化学研究的最大成果之一。

鸡蛋清中的溶菌酶是研究得最清楚的一种溶菌酶。它是一种纯品为白色或微黄色的结晶体，化学性质稳定，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇的碱性球蛋白。它能够催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒性，广泛应用于临床医学、食品工业、发酵工程、基因工程、细胞工程等，溶菌酶所具有的广泛用途被国内外众多学者所研究。为此本试验在结合实验室现有条件对鸡蛋清溶菌酶的提取技术进行了探究。

一、材料与方法

（一）材料

市售新鲜鸡蛋；枯草芽孢杆菌；标准蛋白Marker；724树脂；聚乙二醇4000：样品溶解液；浓缩胶；电极缓冲液；固定液；染色液；脱色液等常用化学试剂。

（二）方法

（1）溶菌酶的提取及纯化

鸡蛋清样品制备及粗分离。将洗净的4～5个新鲜鸡蛋打破，分离得鸡蛋清，量其体积，加入两倍蛋清体积的去离子水，搅拌拌匀，过滤杂质，然后用1mol/L的HCI溶液调pH值至7.0左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。

724弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析。

724树脂再生处理：首先将干树脂清水浸泡，充水膨胀除去细小颗粒和较大杂质；1mol/L的HCI溶液浸泡4～6 h，用去离子水洗至pH值接近5.5；1 mol/L的NaOH浸泡6 h，去离子水洗至近中性；再用1mol/L的NaCl溶液处理6 h，使之转型为Na+型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加0.151mol/L、pH值为6.5的磷酸缓冲液平衡，待用；吸干缓冲液后，将处理好的蛋清约200ml，加入约32 g再生的724树脂中，缓慢搅拌吸附6 h，4℃静置过夜。

洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白。滤干树脂，用等体积的0.15mol/L pH值为6.5的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10%（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来。收集洗脱液.4℃冰箱静置过夜。次日，有白色沉淀析出，离心收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品。

聚乙二醇浓缩：盐析物用1倍去离子水溶解成稀糊状。装入透析袋.在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24 h左右.离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入l mol/L氢氧化钠溶液.同时不断搅拌，使pH值上升至8.0～9.0，如有白色沉淀，即离心去除。

冷冻干燥：用3 mol/L盐酸调pH值至5.0.冷冻干燥。即得白色片状溶菌酶。

（2）溶茵酶的检测

溶菌酶得率：收集冷冻干燥后留在培养皿上的白色粉末，称重。

纯度检测：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。①凝胶板的制备：用30%分离胶贮液、pH值为8.9分离胶缓冲液、10%浓缩胶贮液、pH值为6.7浓缩胶缓冲液、10%SDS、1%TEMED、重蒸馏水、10%APS溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液点样于凝胶板上；③电泳：电流为10mA，时间4 h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干净。再用脱色液脱色。

溶菌酶活力测定：①菌悬液的制备：将培养24 h的枯草芽孢杆菌用蒸馏水将菌体从培养基上洗下，4000r/min离心20 min，倾去上清液。用冷丙酮洗涤，4000r/min离心20 min.不溶物即为菌体。取5mg菌体，加入30mL，0.1mol/L pH值为6.2的磷酸缓冲液，制备菌悬液，于波长450 nm处测定吸光值（A值）；②酶液的制备：称取溶菌酶粉末5mg，用0.1 mol/L， pH值为6.2的磷酸缓冲液配成l mg/mL的酶液。使用时稀释20倍；③活力测定：将酶液和底物悬液分别置于25℃水浴保温10～15min.吸取菌悬液2.8 mL，然后加入酶液0.2mL，迅速摇匀。每隔1min测定1次A450值，共测4次，计算酶的活力单位。

二、结果与分析

（一）724树脂再生

在实验过程中再生前的724树脂，呈深褐色；经过1mol/l的HCI溶液浸泡4 h水洗后的树脂，呈浅黄色；经过1mol/l NaOH溶液浸泡6 h水洗后的树脂，树脂变为肉色；吸附蛋清后的树脂，颜色发白，变得很黏稠。

（二）溶菌酶提取及检测

（1）溶茵酶的得率及纯度检测

将冷冻干燥后收到的溶菌酶称重，约为0.0317g。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检测。从标准蛋向Marker的条带来看，最下面的1条带为溶菌酶的条带，分子量为14.4kD，与之相对应右边的蛋白样品中也分离得到了溶菌酶的条带，而且加样量越大颜色越深。结果表明，该方法从鸡蛋清中分离出的溶菌酶纯度较高，大部分的杂蛋白已除去，而且加样量越大颜色越深。颜色的深浅与染料的选择及浓度和染色时间有关，一般染料浓度越高，染色时间越长，染色越深。但脱色也更难。在本试验中，固定染色0.5h比较合适，脱色时在摇床上洗脱过夜效果最好。

（2）溶菌酶活力检测 表1为加入溶菌酶后.枯草芽孢杆菌在4 min内.每隔l min所测的吸光值。根据酶活力计算公式。算出该酶的活力。结果表明。所提取溶菌酶的活力为7793 U/mg。

表1加入溶菌酶后枯草芽孢杆菌的吸光值项目

三、讨论

目前溶菌酶的提取主要就是对蛋清先粗提再纯化的一个过程。本试验在实施过程中，根据试验相关材料的理化性质，对试验步骤做了一些改进.以期达到更好的效果。如724树脂经碱液浸泡过后很难洗至中性，且碱性很强。改用NACL溶液浸泡同样可以将树脂转为Na+型，且很容易洗至中性。又如用10%的硫酸铵洗脱树脂吸附的物质时。需要过柱，但因为过柱有拖尾现象，所以直接用搅拌洗脱，多洗几次，交换也能很充分，避免了过柱的麻烦。另外，聚乙二醇浓缩和离心浓缩可交替反复使用，视具体情况而定。从试验结果可以看到，提取出来的溶菌酶的纯度和活力都比较高，说明了提取纯化方法的选择和交叉运用只要符合提取物的理化性质，都能有较好的效果，而其对溶菌酶提取效果的影响则需要进一步探究。