细胞角蛋白19和间隙连接蛋白43在4—亚基硝氧喹啉诱发大鼠舌黏膜癌变过程中表达的研究

冯燕　康晓洁　黎春晖　聂敏海

[摘要] 目的 研究4-亚基硝氧喹啉（4NQO）诱发大鼠口腔黏膜癌变过程中细胞角蛋白19（CK19）和间隙连接蛋白43（Cx43）的表达，探讨口腔黏膜癌变过程中CK19与Cx43的相关性。方法 利用4NQO诱导SD大鼠的口腔黏膜癌变，运

用免疫组织化学的方法检测CK19、Cx43在口腔黏膜癌变过程中各阶段的动态变化。结果 在大鼠正常舌黏膜组织中，CK19阳性染色的细胞散在分布于黏膜基底层；随着大鼠舌黏膜上皮异常增生程度的增加，CK19表达于黏膜基底上层；在口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织中，CK19阳性染色细胞分布在黏膜各层。CK19在正常舌黏膜、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、OSCC组织中阳性表达率分别为30.00%、50.00%、58.33%、80.00%、91.67%，差异有统计学意义（P<0.05）。在正常舌黏膜中Cx43蛋白主要表达于大鼠舌黏膜上皮细胞的细胞膜上，上皮

的基底层、棘层和颗粒层呈阳性染色。随着大鼠舌黏膜上皮异常增生程度的增加，Cx43的表达明显下降。Cx43在正常舌黏膜、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、OSCC组织中阳性表达率分别为100.00%、85.71%、66.67%、40.00%、33.33%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 在大鼠舌黏膜癌变过程中，CK19蛋白表达水平随病变程度加重显著升高，提示CK19与口腔上皮细胞的癌变有关；Cx43蛋白表达水平随病变程度加重显著下降，Cx43表达下降是口腔黏膜癌变的早期事件。CK19与Cx43蛋白表达呈负相关，CK19和Cx43的联合检测对OSCC的早期诊断有重要的作用，有利于提高OSCC早期诊断的灵敏度和特异性。

[关键词] 口腔鳞状细胞癌； 细胞角蛋白19； 间隙连接蛋白43； 免疫组织化学

[中图分类号] R 739.8 [文献标识码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.006

口腔癌发病率居头颈部恶性肿瘤的第二位，其中90%以上为鳞状细胞癌，5年生存率为50%[1]。早发现、早诊断和早治疗是目前提高口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者生活质

量和生存率的关键所在。细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）为Ⅰ型角蛋白，主要表达于单层上皮的上皮细胞，也散在表达于复层鳞状上皮的基底层细胞[2-3]。其在口腔颌面部多种病变中均有表达，但是

口腔中的研究多局限于检测不同分化程度鳞癌组织中CK19的表达变化，缺乏对其在口腔黏膜癌前病变的动态研究。该蛋白能否作为早期诊断OSCC的指标未进行深入研究，也未得出一致结论。

在肿瘤细胞以及转化细胞普遍存在细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication，

GJIC）的缺陷[4]，在细胞间隙连接蛋白（connexin，Cx）家族中Cx43分布最为广泛，受到了广泛关注和深入研究。近年来的研究发现，Cx43蛋白在多种正常组织中高表达，但在相应的癌组织中出现表达下调、异位表达或表达缺失[5-8]。GJIC缺陷与肿瘤的发生发展密切相关，但与口腔黏膜癌变的相关性的研究资料较少。

本文通过观察CK19和Cx43在SD大鼠口腔黏膜癌变过程中的表达，从而探寻CK19和Cx43与口腔黏膜癌变的关系及意义。

1 材料和方法

1.1 标本

随机选取58只雄性SD大鼠，3～4只一笼同室饲养，均用常规饲料喂养。分为实验组（48只）和对照组（10只）。实验组大鼠饮用水中加入4-亚基硝氧喹啉（4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO）（40×10-6 mg·L-1）诱癌，分批处死，取舌体组织；对照组饮自来水，与最后一批实验组动物同时处死，取舌体组织。切取的组织包埋切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，由2位有经验的病理医师进行病理诊断。本实验根据病理诊断结果，对58例标本进行分组：正常黏膜组10例；轻度上皮异常增生组14例；中度上皮异常增生组12例；重度上皮异常增生组10例；OSCC组12例。

1.2 方法

采用免疫组织化学SP法来观察CK19和Cx43在SD大鼠口腔黏膜癌变过程中表达的变化，染色过程中设阳性和阴性对照。CK19用已知阳性切片作为阳性对照，Cx43用已知阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。兔抗大鼠CK19（M259）多克隆抗体和兔抗大鼠Cx43（S369）多克隆抗体、免疫组化试剂盒SP-9000 HistostainTM-Plus Kits和显色试剂盒（即用型DAB显色试剂盒）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 观察方法和结果判定

观察由本研究者在有经验的病理医生指导下完成。CK19阳性染色部位为细胞浆和细胞膜，以细胞浆和细胞膜中出现黄色或棕黄色着色为阳性染色；Cx43蛋白以细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。随机选择5个高倍视野（400倍）计数阳性细胞数，以确定每个视野的阳性率；取其平均值作为该例的阳性率，并判定细胞染色强度。综合染色强度和阳性率进行分析处理。染色强度评分标准：无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；阳性细胞比例评定标准：<5%为0，5%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，>75%为4。2项结果相加记为标记指数（labeling index，LI），并通过LI判断表达强度和表达阳性率。<2为阴性（-），2～3为弱阳性（+），4～5为中度阳性（++），6～7为强阳性（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行分析，组间比较采用多个样本比较的秩和检验、多个样本间两两比较的秩和检验及2趋势检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CK19在大鼠舌黏膜癌变各阶段组织中的表达

在大鼠正常舌黏膜组织中，CK19阳性染色的细胞散在分布于黏膜基底层，基底上层不表达；随着大鼠舌黏膜上皮异常增生程度的增加，CK19表达于黏膜基底上层；在OSCC组织中，CK19阳性染色细胞分布在黏膜各层，浸润到黏膜下组织的癌细胞也呈阳性染色（图1）。

CK19在大鼠正常舌黏膜、上皮异常增生、鳞状细胞癌组织中的表达情况见表1。由表1可见，在正常舌黏膜、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、OSCC组织中CK19阳性表达率分别为30.00%（3/10）、50.00%（7/14）、58.33%（7/12）、80.00%（8/10）、91.67%（11/12）。正常舌黏膜与重度上皮异常增生和OSCC，轻度上皮异常增生与重度上皮异常增生和OSCC，中度上皮异常增生与OSCC，两两组相比较，差异有统计学意义（P=0.001），说明正常舌黏膜、上皮异常增生和OSCC表达CK19差异有统计学意义。随着病变程度加重，CK19表达强度增强，阳性率增加（2趋势=10.771，P<0.05）。

2.2 Cx43在大鼠舌黏膜癌变各阶段组织中的表达

在正常舌黏膜中Cx43蛋白主要表达于大鼠舌黏膜上皮细胞的细胞膜上，上皮的基底层、棘层和颗粒层呈阳性染色，在角质层中未见其表达。随着大鼠舌黏膜上皮异常增生程度的增加，Cx43蛋白的表达明显下降；在OSCC组织中，Cx43阳性染色分布于癌细胞细胞浆以及鳞状细胞癌组织中的角化珠内（图2）。

Cx43在大鼠正常舌黏膜、上皮异常增生、鳞癌组织中的表达情况见表2。由表2可见，在正常舌黏膜、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、OSCC组织中的阳性表达率分别为100.00%（10/10）、85.71%（12/14）、66.67%（8/12）、

40.00%（4/10）、33.33%（4/12）。正常舌黏膜与中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、OSCC，轻度上皮异常增生与重度上皮异常增生、OSCC，中度上皮异常增生与OSCC，两两组相比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明在正常舌黏膜、上皮异常增生和OSCC组织中Cx43表达随着病变程度增加而显著降低（2趋势=15.536，P<0.001）。

2.3 大鼠舌黏膜癌变过程中CK19和Cx43的相关性

鼠舌黏膜癌变过程中CK19和Cx43的相关性见表3。Spearman相关分析发现：在大鼠舌黏膜癌变各阶段中CK19和Cx43的表达具有相关性，呈负相关（相

关系数r=-0.889，P=0.000），随病变程度加重，Cx43表达下降，而CK19表达增强。

3 讨论

OSCC是最常见的口腔恶性肿瘤，近年来OSCC的发病率有增多趋势，而且发病年龄有减小趋势，严重危害人类的健康与生命。口腔黏膜上皮异常增生约有4%～16%的癌变率，所以对其发生演变的病因学研究尤为重要[9]。本实验结果显示大鼠正常舌黏膜组

织中，CK19阳性染色的细胞散在分布于黏膜基底层，基底上层不表达；随着大鼠舌黏膜上皮异常增生程度的增加，CK19表达于黏膜基底上层；在OSCC组织中，CK19阳性染色细胞分布在黏膜各层，浸润到黏膜下组织的癌细胞也呈阳性染色。与其他研究[10-12]结

果相似。此外本实验结果显示：在正常舌黏膜、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、OSCC组织中CK19阳性表达率差异有统计学意义（P<0.05），说明正常舌黏膜、上皮异常增生和OSCC表达CK19差异有显著性，随着病变程度加重，CK19阳性率显著增加，表达强度显著增强，与其他研究[11]结果相似；OSCC组与正常舌黏膜、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生组比较差异有统计学意义，重度上皮异常增生组与正常舌黏膜、轻度上皮异常增生组比较差异有统计学意义。目前的研究也表明CK19可能和癌基因有关，如在早期宫颈癌、肺癌、甲状腺乳头状微小癌中可出现肿瘤微转移，此时CK19与正常组织就已出现表达差异。

在Cx家族中Cx43分布最为广泛，受到了广泛关注和深入研究。本实验发现Cx43蛋白主要表达在大鼠舌黏膜上皮角质形成细胞的细胞膜，在正常舌黏膜上皮的基底层呈弱阳性染色，棘层和颗粒层呈强阳性染色，角质层阴性染色，这种表达规律与其他研究[5-8]结果相似。由此推断Cx43的表达分布情况可能与细胞的分化程度相关；Cx43可能是口腔黏膜早期癌变的一种生物标志物。

本实验还发现随着大鼠舌黏膜上皮异常增生程度的增加，Cx43蛋白表达明显下降；在OSCC组织中Cx43异位表达，分布在鳞癌细胞的胞浆及鳞癌组织中的角化珠。笔者推断Cx43的分布状态可能与细胞所处周期相关。在DNA合成期，Cx43既位于胞浆又分布在胞质囊泡和其他胞内间隔；在分裂期，Cx43几乎全部位于胞浆，并呈分散的点状积聚[7]，而舌癌

组织中的癌细胞正好处于快速分裂增殖期。许多免疫组织化学研究已证实Cx43蛋白表达的量与GJIC的能力密切相关，Cx43表达的下降意味着GJIC功能的下降。本研究动态观察了Cx43在4NQO诱导的SD大鼠舌黏膜从正常-轻度上皮异常增生-中度上皮异常增生-重度上皮异常增生-鳞状细胞癌这一动态癌变过程中的表达变化，Cx43表达强度的变化在正常舌黏膜与轻度上皮异常增生组织的比较中无明显差异；但随着癌变程度增加而显著降低，差异有显著性。证实了Cx43表达异常可以发生在癌变的各个阶段，提示在大鼠舌黏膜癌变早期发生了Cx43表达下调。因此笔者推断Cx43表达下调可能是口腔黏膜癌变过程的早期事件，与口腔黏膜癌变的发生密切相关。

细胞角蛋白是细胞骨架体系中性质最为稳定的组分，在细胞质中起支架作用，对维持上皮细胞的形态和连续性起重要作用，与细胞分化、信号转导、迁移、转化、凋亡、基因调控等生命活动相关；而GJIC是相邻细胞间直接交换信息、物质和能量的唯一通道，是维持多细胞组织稳定必不可少的调节机制。GJIC是通过细胞间隙连接（gap junction，GJ）实现的，其基本组成单位是跨膜的Cx，Cx43是一种主

要的细胞间隙连接蛋白，Cx43组成的连接子在质膜上常成簇出现形成间隙连接斑，同样作为维持细胞稳定的成分，两者的表达是否有相关性呢？本研究发现：在大鼠舌黏膜癌变发展中CK19、Cx43蛋白表达呈负相关。随着病变程度加重Cx43表达下降，而CK19表达增强，推测鳞状细胞癌组织中Cx43下降使得Cx表达减少，肿瘤细胞的转移和种植增加，因而使得检测上皮细胞及上皮起源肿瘤微转移的标志物CK19表达增多，为鳞状细胞癌早期诊断及预后判断提供依据。CK19和Cx43的联合检测对OSCC的早期诊断有重要的指导作用，有利于提高OSCC早期诊断的灵敏度和特异性。

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（本文编辑 杜冰）